提高根癌農桿菌介導黑曲霉轉化效率的研究

曹張磊，王德培，張 嵐

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

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提高根癌農桿菌介導黑曲霉轉化效率的研究

曹張磊，王德培，張 嵐

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

摘 要：為提高根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導黑曲霉（Aspergillus niger）轉化（ATMT）效率，本文對影響轉化效率的分生孢子與農桿菌的比例、轉化媒介、誘導溶氧、誘導時間、誘導時乙酰丁香酮（AS）濃度這5個因素進行單因素實驗，最終確定提高其轉化效率的最優條件為：根癌農桿菌誘導過程在400，μmol/L乙酰丁香酮終濃度條件下，100，mL三角瓶中28，℃、100，r/min振蕩培養5，h，分生孢子與根癌農桿菌的比例為1∶100，在硝酸纖維膜媒介上24，℃共培養48，h.在此優化條件下，黑曲霉的轉化效率達到35個/107分生孢子.相比于優化前，轉化效率提升了78%，并且整合至黑曲霉基因組的外源潮霉素B抗性基因在轉接15代以后仍能穩定遺傳.

關鍵詞：黑曲霉；根癌農桿菌；潮霉素B抗性

黑曲霉（Aspergillus niger）現已成為重要的工業發酵菌種之一，廣泛應用于食品加工、輕化紡織、飼料加工、廢物處理、醫藥等領域.工業生產菌株黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88全基因組測序的完成為在分子層面上研究黑曲霉代謝機理、提升菌株性能奠定了理論基礎［1］.根癌農桿菌介導轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法的建立，大大簡化了絲狀真菌的轉化操作，提高了其轉化效率，為絲狀真菌基因功能的研究、有用基因的克隆表達與菌株遺傳性能的改造開辟了一條全新途徑.

根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種能夠侵染植物體受傷的組織細胞的革蘭氏陰性菌，最初應用于植物細胞的基因轉化研究，其能在自然狀態下對受傷的植物細胞所釋放的各種酚類物質產生趨向性，侵染植物傷口進入細胞后，將T-DNA［2］轉入植物細胞內并整合至植物的基因組中，最終導致植物腫瘤的產生，廣泛應用于農業生產中植物體的遺傳改造.De Groot等［3］利用根癌農桿菌轉化了黑曲霉，這為絲狀真菌的遺傳轉化提供了新的研究方法.根癌農桿菌介導黑曲霉轉化效率受到諸多因素的影響，如何提高其在黑曲霉中的轉化效率仍是一個值得研究的課題.黎明等［4］發現孢子懸液的新鮮程度和濃度、農桿菌菌液濃度、共培養時間、共培養溫度這5個主要因素對農桿菌介導黑曲霉的轉化效率產生較大影響.郭慧等［5］發現乙酰丁香酮加入與否對日本曲霉轉化效率有著明顯的影響，進一步驗證了誘導物的添加能活化農桿菌中的毒性蛋白，提高侵染效率.龍朝欽等［6］對根癌農桿菌介導的煙曲霉轉化條件進行優化時發現，轉化媒介對根癌農桿菌介導煙曲霉轉化效率影響顯著.本文曾參考黎明等［4］和Michielse等［7］的實驗方法所得到的轉化子平均個數為15個/107分生孢子，轉化效率低，推測其原因是農桿菌的侵染毒性低.通過查閱文獻，發現很少有學者關注誘導農桿菌過程各因素對轉化效率的影響，因此本文就提高農桿菌侵染毒性即農桿菌在誘導過程中溶氧條件、誘導時間、誘導物乙酰丁香酮濃度以及其他相關提高轉化效率的因素進行了研究，為進一步完善根癌農桿菌介導的黑曲霉遺傳轉化體系奠定基礎.

1　材料與方法

1.1菌株、質粒與培養基

黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 5751、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1、質粒p50均為本實驗室保存.

LB培養基：蛋白胨10，g，酵母粉5，g，氯化鈉10，g，蒸餾水定容至1，L，固體培養基中加入瓊脂粉15，g，121，℃滅菌20，min.

PDA固體培養基：稱取去皮馬鈴薯200，g，切成小塊，加入適量蒸餾水，煮沸30，min，6層紗布過濾，定容至1，L，加入葡萄糖20，g，瓊脂粉20，g，121，℃滅菌20，min.

IM誘導培養基、CM培養基、農桿菌侵染所需培養基及試劑參考文獻［7］配制.

1.2試劑與溶液的配制

Taq DNA聚合酶、T4，DNA連接酶、限制性內切酶等，TaKaRa公司；乙酰丁香酮（AS），Sigma公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、潮霉素B，Solarbio公司；2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸鈉鹽（MES），上海生工生物工程有限公司；其他試劑，天津市北方天醫化學試劑廠.

基因組提取緩沖液：5，mol/L NaCl 20，mL，0.5，mol/L EDTA 100，mL，1，mol/L Tris-HCl（pH 8.5）50，mL，10%， SDS 100，mL，蒸餾水定容至1，L.

TE緩沖液：1，mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10，mL，0.25，mol/L EDTA（pH 8.0）4，mL，蒸餾水定容至1，L.

pH 5.0，HAc-NaAc溶液：稱取NaAc 5.4，g，溶于適量去離子水中，用醋酸調節pH至5.0，定容至100，mL.

苯酚混合物：苯酚、三氯甲烷、異戊醇按體積比24∶25∶1量取混合.

1.3黑曲霉分生孢子的制備

取6，mL滅菌蒸餾水，從培養4，d的黑曲霉PDA平板上洗孢子，用無菌水稀釋孢子懸液，血球計數板計數至孢子密度為2×107，mL-1備用.

1.4根癌農桿菌AGL1感受態細胞的制備

挑取根癌農桿菌AGL1接種于3，mL LB液體培養基中，28，℃、180，r/min培養過夜；取2，mL培養液于100，mL LB液體培養基中繼續培養，至A600為0.5左右；將培養液置冰浴中40，min，4，℃、5，000，r/min離心10，min，棄去上清液；4，℃、10，mL的無菌水離心洗滌1次，棄去上清液；用4，℃、10，mL 10%，甘油懸浮菌體；4，℃、5，000，r/min離心5，min，棄去上清液；用1，mL預冷的10%，甘油懸浮，分裝成每管70，μL，-70，℃保存.

1.5根癌農桿菌的轉化與培養

取1，μL具有潮霉素B抗性基因的重組質粒p50質粒，加到70，μL根癌農桿菌AGL1感受態細胞中，混勻，吸取并加到間距0.2，cm電轉杯中，擦拭干凈，調節電擊電壓2.5，kV，電擊5，ms.將電轉化［8］后的根癌農桿菌涂布于LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上進行篩選，篩選得到的陽性克隆子在LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上劃線，28，℃培養2，d，挑取單菌落接種于5，mL（含100，μg/mL卡那霉素）的LB液體培養基中，28，℃、180，r/min培養16～20，h，將1，mL根癌農桿菌菌液接種于含有相應抗性的100，mL LB液體培養基中，按照同等條件繼續培養至A600為0.8備用.

1.6優化轉化條件

將4，mL（A600=0.8）根癌農桿菌菌液5，000，r/min離心5，min收集菌體，用6，mL含有不同濃度AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM誘導培養基懸浮菌體，在不同溶氧條件下（直徑18，mm試管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶）進行不同時間段（2、4、5、6、8，h）誘導培養，取黑曲霉孢子懸液250，μL，調節誘導后根癌農桿菌菌液濃度，按黑曲霉孢子與農桿菌不同比例（1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000）等體積混合均勻，涂布在不同的轉化媒介（尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜、醋酸硝酸混合膜）的IM固體培養基上，24，℃避光培養48，h，然后將混合體系用無菌水稀釋后涂到含有150，μg/mL潮霉素B平板上進行初篩，培養4～5，d，隨后轉接至200，μg/mL潮霉素B進行復篩，每種條件重復3次，驗證轉化子后記錄轉化子個數.以107個分生孢子所得到的具有潮霉素B外源基因的轉化子個數來表示轉化效率.具體操作詳見文獻［7］.

1.7轉化子驗證及遺傳穩定性的驗證

提取黑曲霉轉化子基因組，以潮霉素B抗性基因序列設計引物（見表1），PCR方法驗證.

表1　潮霉素B引物Tab.1　Primers of hygromycin B

從篩選培養基中隨機選取轉化子在CM培養基中培養傳代，轉接15代以后，提基因組對潮霉素B進行PCR驗證，確定抗性基因的穩定性.

1.8統計學方法

用Mintab 16統計軟件進行單因素方差分析.

2　結果與討論

2.1黑曲霉對潮霉素B的敏感性

根癌農桿菌介導的絲狀真菌轉化體系的構建可以使用多種形式的受體細胞，如原生質體、分生孢子、菌絲體等［3］，本實驗采用了較易制備的分生孢子作為受體.所以用黑曲霉孢子對潮霉素B進行敏感性實驗.

將黑曲霉孢子懸液涂布于含有不同濃度潮霉素B的CM培養基中培養，觀察菌體生長情況，結果見表2.隨著潮霉素B質量濃度增大，黑曲霉的生長逐漸受到抑制，當質量濃度達到150，μg/mL時，黑曲霉已經無法生長.本實驗選擇150，μg/mL潮霉素B為初篩質量濃度，200，μg/mL潮霉素B為復篩質量濃度.

表2　黑曲霉CGMCC 5751對潮霉素B的敏感性Tab.2　Sensitivity of A. niger CGMCC 5751 to hygromycin B

2.2黑曲霉分生孢子與根癌農桿菌的比例對轉化效率的影響

在其他條件一樣的情況下，取2×107，mL-1黑曲霉孢子懸液250，μL與不同濃度根癌農桿菌250，μL混合，最終按體積比為1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000充分混勻，涂布在IM固體平板上，24，℃避光培養48，h，然后轉移到CM篩選平板（含150，μg/mL潮霉素B）上篩選轉化子，實驗結果如圖1所示.在一定范圍內（1∶1～1∶100），黑曲霉分生孢子與根癌農桿菌的比例增加時，轉化子的數量隨之提高，但是當達到1∶1，000時，轉化子的數量反而降低.單因素方差分析顯示比例為1∶100時轉化效率最佳，與其他各組的差異具有統計學意義（P＜0.01）.然而提高至1∶1，000時轉化子反而減少，分析原因是根癌農桿菌濃度過高，與黑曲霉共同競爭培養基中的營養物質，同時也使其轉接至選擇培養基上后不易被清除，影響轉化子的生長［9］.

圖1　黑曲霉分生孢子與根癌農桿菌的體積比對轉化效率的影響Fig.1　Effect of A. niger conidia to A. tumefaciens ratio on transformation efficiency

2.3誘導培養基中加入AS濃度對轉化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有不同濃度的AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM誘導培養基懸浮菌體，在相同的實驗條件下進行介導轉化，結果如圖2所示.AS濃度為400，μmol/L時，轉化效率最高，與其他各組的差異具有統計學意義（P＜0.01）.

不同AS濃度對根癌農桿菌誘導影響較大，過高或過低的AS濃度都不利于轉化的進行，實驗設立4個不同的濃度梯度對其進行研究，發現當AS誘導濃度為400，μmol/L時，根癌農桿菌對黑曲霉的轉化效率最高.ATMT是通過根癌農桿菌中Ti質粒內毒力區編碼的各種蛋白共同作用來實現的，而AS對根癌農桿菌中的毒性基因起到誘導或輔誘導作用［10］，激活毒力區基因的表達.在一定濃度范圍內，隨著AS濃度的增加轉化效率也隨之提升，這與De Groot等［3］的研究結果一致.但當AS濃度超過400，μmol/L后，隨著AS濃度的增加轉化效率反而下降，其原因可能是AS過量會抑制毒蛋白的活性，降低其侵染效率，同時過高的AS濃度對黑曲霉生長產生一定的抑制，導致轉化子數量減少.

圖2　 誘導培養基中加入AS的濃度對轉化效率的影響Fig.2　Effect of concentration of AS in inducing medium on transformation efficiency

2.4誘導根癌農桿菌時溶氧對其轉化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM誘導培養基懸浮菌體，分別于直徑18，mm試管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶中誘導培養至A600=0.8，在相同的實驗條件下進行介導轉化，結果如圖3所示.隨著誘導培養時溶氧的增大，轉化效率也隨之上升，差異具有統計學意義（P=0.001）.

圖3　 誘導溶氧對轉化效率的影響Fig.3　Effect of inducing dissolved oxygen on transformation efficiency

根癌農桿菌誘導培養時溶氧的高低對轉化效率也產生一定的影響.隨著溶氧的增加，根癌農桿菌代謝旺盛，細胞增殖，活力增強，其所分泌的毒蛋白活性也相應增強［11］，使T-DNA更容易侵入進宿主細胞內，轉化效率也相應提高.

2.5誘導時間對轉化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM誘導培養基懸浮菌體，將根癌農桿菌菌液分別誘導培養2～8，h，培養后將根癌農桿菌菌體濃度調成一致，在相同的實驗條件下進行介導轉化，結果如圖4所示.隨著誘導時間的延長，轉化效率也相應增大，誘導時間為5，h效果最好，低于此時間，轉化效率明顯下降，高于此時間效率有所下降，并且各組數據間差異具有統計學意義（P＜0.01）.這說明誘導時間過短或過長都不利于轉化介導.其原因是過長的誘導時間會導致毒蛋白活性下降，同時也會導致大量假陽性轉化子的產生，而過短的誘導時間又無法激活毒力區基因的表達，影響轉化效率.

圖4　 誘導時間對轉化效率的影響Fig.4　Effect of inducing time on transformation efficiency

2.6轉化媒介對轉化效率的影響

取2×107，mL-1黑曲霉孢子懸液250，μL，與等體積的誘導后根癌農桿菌菌液（A600=0.8）混勻，二者比例為1∶100分別涂在貼有尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜、醋酸硝酸混合膜的IM固體誘導培養基上，24，℃避光培養48，h，然后轉移到CM（150，μg/mL潮霉素B）篩選平板上篩選轉化子，結果如圖5所示.硝酸纖維膜轉化效果要明顯優于其他媒介，尼龍膜效果最差，組間具有明顯差異（P＜0.01）.

能夠作為共培養媒介的物質有很多，如尼龍膜、硝酸纖維膜、玻璃紙等都曾被報道應用于絲狀真菌的轉化［12-15］，其原理是媒介能將菌體與培養基分離，但不影響菌體對培養基中營養物的吸收及其自身生長.本研究結果表明，用硝酸纖維膜進行根癌農桿菌介導黑曲霉要明顯優于其他轉化媒介，其原因可能是不同的膜具有不同的化學特性與吸附能力，其會影響農桿菌細胞與黑曲霉孢子的相互作用，從而導致轉化效率的不同.硝酸纖維膜轉化效果最優可能是由于其對毒性蛋白質具有高度的親和性［16］.

圖5　 轉化媒介對轉化效率的影響Fig.5　Effect of transformation media on transformation efficiency

2.7轉化子的驗證及遺傳穩定性鑒定

隨機挑取10個轉化子，提取基因組進行PCR驗證，10個轉化子均能擴增出潮霉素B的片段.將這10個轉化子培養15代后提取基因組進行PCR驗證，均能擴增出潮霉素B的片段，結果如圖6所示，轉化子的潮霉素基因可以穩定遺傳.

圖6　 黑曲霉CGMCC 5751轉化子PCR結果Fig.6　PCR results of the A. niger CGMCC 5751 transformants

2.8根癌農桿菌介導條件優化前后轉化效率對比

將各單因素實驗的最優條件綜合后對黑曲霉進行介導轉化實驗，并與優化前的實驗方法［4］進行對比，結果見表3.107分生孢子中轉化子個數從平均8個上升至35個，并且在篩選平板上轉化子生長明顯加快（P＜0.01），轉化效率明顯提高.

表3　優化根癌農桿菌介導轉化條件前后轉化效率的對比Tab.3　Comparison of transformation efficiency before and after the optimization of A. tumefaciens-mediated transformation conditions

3　結 論

本文利用根癌農桿菌AGL1介導侵染黑曲霉，優化其轉化條件，尤其是在誘導根癌農桿菌過程中各因素優化成功，進一步驗證了根癌農桿菌轉化體系對絲狀真菌的可行性.通過本實驗得出添加400，μmol/L乙酰丁香酮，100，mL搖瓶誘導根癌農桿菌AGL1培養5，h，調節黑曲霉孢子與根癌農桿菌體積比為1∶100，用共培養媒介硝酸纖維膜，根癌農桿菌AGL1介導侵染黑曲霉效果最好，107個分生孢子中黑曲霉轉化子可達35個，相比于優化前的轉化方法，轉化效率提高了78%，.農桿菌介導絲狀真菌轉化體系的確立，克服了原有絲狀真菌轉化體系操作繁雜、轉化效率低、耗時多等缺點.通過研究影響根癌農桿菌介導黑曲霉轉化條件的優化，基本上確立了該方法在黑曲霉遺傳轉化上的一些特性，雖然對于不同的曲霉，其最優的轉化條件存在著一定的差異，但對于絲狀真菌遺傳轉化系統的建立具有重要的參考價值.

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責任編輯：郎婧

Improvement of Transformation Efficiency of Aspergillus niger Mediated by Agrobacterium tumefaciens

CAO Zhanglei，WANG Depei，ZHANG Lan

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To improve the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation（ATMT）efficiency of Aspergillus niger，we performed some single-factor tests for five factors：ratio of conidia to bacterium，transformation media，inducing dissolved oxygen，inducing time and inducing concentration of acetosyringone（AS）.The optimum conditions to improve the transformation efficiency were as follows：A tumefaciens was cultivated in 400，μmol/L AS at 28，℃ and 100，r/min for 5，h in 100，mL conical flask；co-cultivation was conducted at a 1∶100，ratio of conidia to bacterium on nitrocellulose membrane at 24，℃ for 48，h.Under the above optimized conditions，the transformation efficiency of A.niger achieved 35，transformants/ 107，conidia. The transformation efficiency was increased by 78%， compared with that before optimization，and all the selected hygromycin B resistant transformants were genetically stable after 15 subcultures on complete medium.

Key words：Aspergillus niger；Agrobacterium tumefaciens；hygromycin B resistance

中圖分類號：Q933

文獻標志碼：A

文章編號：1672-6510（2016）02-0020-06

收稿日期：2015-04-27；修回日期：2015-08-04

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31471725）

作者簡介：曹張磊（1990—），男，浙江人，碩士研究生；通信作者：王德培，教授，shiyao218@163.com.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150054