CoxA16感染不同病情手足口病患者NK細胞表達變化及臨床意義*

李莉

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CoxA16感染不同病情手足口病患者NK細胞表達變化及臨床意義*

李莉①

【摘要】目的：分析探討NK細胞在CoxA16感染的不同病情手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）患者中的表達差異及臨床意義。方法：收集2015年4-8月本院感染科確診的CoxA16感染HFMD病例外周血標本54例，按臨床表現分為普通型組（16例）、重型組（18例）和危重型組（20例）；同時，收集EV71感染重型HFMD病例18例作為對照組?；颊吣挲g均為15～24個月。采用流式細胞術對上述外周血標本中NK細胞進行檢測。結果：與正常健康兒童NK細胞參考值比較，普通型患者中NK細胞在淋巴細胞亞群中的相對百分比明顯增高，而在重癥病例中，重型患者NK細胞相對百分比降低，危重型病例NK細胞卻顯著升高。普通型組與重癥組（包括重型組及危重型組）及重型組與危重型組組間NK細胞百分比比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。此外，EV71感染重癥病例中NK細胞百分比高于正常值，與CoxA16感染重癥病例的NK細胞低于正常值相反，兩組間NK細胞表達差異比較有統計學意義（P＜0.05）。結論：CoxA16感染HFMD患者外周血中NK細胞的表達與其病情進展程度具有很大的相關性；而且在重癥HFMD病患者中NK細胞的表達高低還與患者感染的不同病毒類型有關。推測NK細胞在不同病情HFMD中的活化效應不僅受到感染病毒致病性高低的影響，而且在病情危重時，在很大程度上主要受到危重型臨床癥狀的影響。

【關鍵詞】NK細胞； CoxA16； 手足口?。?EV71； 臨床意義

①昆明市兒童醫院 云南 昆明 650228

First-author’s address：Kunming Children’s Hospital，Kunming 650228，China

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是全球性兒童傳染疾病，近年來在亞太地區暴發流行呈上升趨勢，以2歲左右兒童感染居多［1-3］。引發HFMD的致病病原體主要包括腸道病毒71（Enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒16（CoxA16）兩種，其中EV71具有嗜神經毒性，能夠引發神經系統并發癥，病情危重時會導致患者死亡；目前大量研究集中于對其致病分子機制研究［4-6］。而對于CoxA16，多數報道顯示其引發的HFMD病情較輕，重癥病例數相對較少，因此，研究相對較少；但自2008年其在芬蘭引發HFMD暴發流行以來，目前也被認為是與EV71同樣可以導致患者病情發展至危重、甚至死亡的致病病原體［7-8］。

NK細胞，作為人體內抗病毒免疫反應的主要免疫細胞之一，在病毒感染后，不僅能直接釋放顆粒酶和穿孔素殺傷和清除已感染的靶細胞，而且還能產生大量炎性因子、免疫調節因子抑制病毒的表達。同時NK細胞還可激活、招募其他效應細胞參與抗病毒免疫應答，誘導感染細胞發生凋亡［9］。文獻［10］表明，NK細胞缺乏不僅會增加CMV、VZV、HSV、痘病毒以及流感病毒的易感性，而且會加重疾病的病情。這說明，NK細胞減少或缺失很可能是病毒感染后影響疾病發展惡化的風險因素之一。目前，對于CoxA16感染后，HFMD患者體內的NK細胞功能尚無定論，因此，本研究旨在尋找發現NK細胞在CoxA16感染的不同病情HFMD中的作用及臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料 采集2015年4-8月本院感染科確診的CoxA16感染手足口病患者外周血標本54例；患者年齡15～24個月；按臨床分類分為普通型組16例、重型組18例及危重型組20例。此外，還收集了15～24月年齡段EV71感染重癥手足口病病例外周血標本15例作為對照。各組間一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2診斷標準 根據衛生部頒發的《手足口病診療指南》（2010年版）及《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識》（2011年版）的診斷標準按照臨床分類［11-12］，即普通型病例（手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴發熱）；重癥病例，包括重型（出現神經系統受累表現，如：精神差、嗜睡、易驚醒、譫妄；頭痛、嘔吐；肢體抖動，肌陣攣、眼球震顫、共濟失調、眼球運動障礙；無力或急性遲緩性麻痹；驚厥。體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失）以及危重型（出現下列情況之一者：頻繁抽搐、昏迷、腦疝或呼吸困難、紫紺、血性泡沫痰、肺部羅音等或休克等循環功能不全表現）收集病例。

1.3試劑及主要儀器 試劑：采用BD公司生產的檢測淋巴細胞亞群的試劑盒 BD Multitest 6-color TBNK Reagent。該試劑盒中含有識別富集不同淋巴亞群（T細胞、B細胞以及NK細胞）的抗體，其中包括識別NK細胞的抗體（CD16和CD56 PE）、識別T細胞的抗體（CD3 FITC）、為淋巴細胞群設置的CD45 PerCP-Cy?5.5、檢測CD4+T細胞的CD4 PE-Cy?7、識別B淋巴細胞的CD19 APC以及識別CD8+T細胞的CD8 APC-Cy7。主要檢測儀器：BD FACSCanto?，使用BD FACSCanto?軟件進行參數設置、質控監測以及數據分析。

1.4方法 流式細胞儀檢測：采集患者靜脈血2～3 mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作說明書，分別向已編好號的試管中加入20 μL六色單克隆抗體和同型對照；分別向試管中加入混勻的100 μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育15～20 min；加入已稀釋好的溶血素600 μL混勻避光室溫溶血8～10 min；上機檢測。

1.5統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，以中位數及5%～95%置信區間表示各組NK細胞的表達情況，比較采用 X2檢驗；計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK細胞的表達比較 數據結果顯示，普通型HFMD患者外周血淋巴細胞亞群中NK細胞百分比（15.850%）顯著高于正常健康兒童NK細胞參考值（8.000%），而在重癥病例中，NK細胞在臨床分類的重型以及危重型HFMD中表達不一致；重型時為6.535%，低于正常值，而危重型時為22.645%，顯著高于正常值。由此提示在普通型病例中，NK細胞可能發揮著重要的抗病毒免疫效應；但在病情發展至重癥時，NK細胞發揮的免疫效應很可能因患者重癥程度病情不同而表現不同，見表1。

表1　CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK細胞的表達比較 %

2.2NK細胞表達變化與病情嚴重程度之間的關系比較 重型組NK細胞表達為（6.394±2.036）%，明顯低于普通型組的（16.423±4.438）%和危重型組的（25.284±9.725）%，差異比較均有統計學意義（P＜0.05）；且普通型組明顯低于危重型組，差異比較有統計學意義（P＜0.05）。由此說明，15～24個月年齡段、CoxA16感染的HFMD患者外周血中NK細胞的表達變化與患者的不同病情間具有很大的相關性，見圖1。

圖1　NK細胞表達變化與病情嚴重程度之間的關系比較

2.3CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細胞表達比較 與正常健康兒童參考值（8.000%）比較，EV71感染的重型HFMD患者外周血NK細胞百分比明顯升高升高，與CoxA16感染的重型HFMD患者NK細胞百分比降低的情況相反，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。在重型HFMD患者體內，NK細胞的表達變化與患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）類型間具有一定的相關性。即不同病毒感染情況下，NK細胞受病毒刺激活化程度不同，表達差異也相對明顯，見圖2。

表2　CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細胞表達比較 %

圖2　CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細胞表達比較

3　討論

病毒感染后，NK細胞作為主要免疫細胞之一，同T細胞、B細胞一起在機體內發揮著非常重要的抗病毒免疫作用［13-15］。目前關于NK細胞發育的最新研究同時觀察到NK細胞和細胞毒性T細胞（CTL細胞）在反應時相及高峰出現上有顯著互補，即NK細胞反應在前，CTL細胞緊隨其后。當CTL細胞反應遲鈍或缺乏時NK細胞的高峰及持續時間會自動延后。這提示NK細胞對CTL有調節作用，而且NK細胞的發育很可能早于T細胞［16］。基于此，筆者推測，處于成長發育期兒童體內的NK細胞功能也很可能優于T細胞，而且還有一種情況是T細胞功能受抑時，NK細胞發揮的抗病毒免疫反應很可能更強。

對于成長期的兒童，其體內的淋巴細胞亞群與年齡密切相關，有文獻報道，年齡處于15～24個月的正常健康兒童，其外周血中NK細胞百分比相對較低（8.000%）。當年齡大于2歲后，NK細胞隨年齡增大而逐漸增多，成人時，NK細胞達13.000%。本研究中選取的患者病例年齡均處于15～24個月，在病毒刺激情況下，普通型及危重型患者NK細胞均明顯升高，而重型患者NK細胞減低；而且普通型與重型、危重型以及重型與危重型間NK細胞表達比較均有顯著差異，一方面說明NK細胞的表達與CoxA16感染的不同HFMD病情有關，另一方面也提示即便同是重癥HFMD，重型及危重型患者體內NK細胞的表達也可能會截然相反。這可能與CoxA16感染的重癥HFMD患者在不同臨床表現時，其體內的免疫功能已經出現紊亂有關。

NK細胞作為機體內的非特異性殺傷細胞，在病毒急性感染初期，可迅速擴增殺死體內已感染病毒細胞，但在持續感染期，其殺傷病毒感染細胞的功能很可能因病毒的干擾而受到抑制［10，17-18］。有研究顯示在急性HBV感染早期，NK細胞的殺傷作用增強，而在慢性乙型肝炎、肝硬化患者體內NK細胞數量及活性均受抑制，提示HBV的持續存在很可能與病毒抑制NK細胞為代表的固有免疫系統功能有關［19］。本研究中發現的CoxA16感染早期，普通型HFMD患者NK細胞顯著升高；而當病情發展至重型時，機體內NK細胞減低，該結果與上述研究結果相符。對于本研究中發現的危重型病例NK細胞顯著升高的原因，可能在于危重型時，患者體內免疫功能的變化在很大程度上受到了患者危重的臨床癥狀的影響，由于致病病毒對于患者中樞神經系統的嚴重干擾，患者出現抽搐、昏迷、腦疝、呼吸困難等非常嚴重的臨床癥狀，危及生命，此時，對機體內部免疫功能起調節作用的神經-免疫信號網絡很可能發揮著主要的作用，NK細胞數量激增很可能與該信號通路活化明顯有關，對于相關分子機制研究后期將進行深入分析。

對于本研究發現的在重型HFMD患者體內，NK細胞的表達變化與患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）類型相關的結果，筆者認為與致病病毒的毒性強弱有關；本研究中，CoxA16感染重型患者NK細胞減低，而EV71感染重型患者NK細胞增高。造成該現象的原因一方面推測為因CoxA16致病毒性相對EV71較弱，所以其刺激NK細胞活化的能力也相對較弱；另一方面也說明EV71的致病機制與其他腸道病毒致病機制不同，這也可能是其致病分子機制目前還尚無定論的原因之一。

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Clinical Significance of the NK Cells Expression Changes in HFMD Patients Infected by CoxA16 with Different Severity Degrees

LI Li.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：008-012

【Abstract】Objective：To compare and analyze the different expression of NK lymphocytes subset in peripheral blood in children with different severity degree of hand-foot-mouth disease（HFMD） after CoxA16 infection.Method：The peripheral blood samples of 54 CoxA16 infected patients from the confirmed cases with foot-and-mouth disease in the infectious disease department in our hospital from April 2015 to August 2015 were collected and devided into 3 groups according to the difference of severity degree，16 patients in the mild cases group，18 in the severe cases group，and 20 in critical illness cases group.separately.The other 18 peripheral blood samples of EV71 infected severe HFMD patients were selected as the control group.All the patients aged 15 to 24 months.The expression of NK lymphocyte in all cases above were detected by flow cytometry.Result：Compared to the reference value of NK cells in healthy children，the percentage of NK cells in peripheral blood was obviously elevated in the mild cases group，while it showed decreasing expression in the severe cases group patients but evident increasing in the critical illness cases group.Moreover，it had significantly differences between either the mild cases group and the two severe symptom cases（contain the severe cases group and critical illness cases group） or the severe cases group and critical illness cases group（P＜0.05）.Besides，contrasted to the decreasing expression of NK cells in CoxA16 infected cases，it showed obvious rising of NK cells in EV71 infected severe patients，of which the difference was also statistic significant（P＜0.05）.Conclusion： The expression of NK cells in peripheral blood were associated with the severity of the clinical manifestations in different CoxA16 infected patients，what’s more，it related to the different type of virus in the severe type cases.Thus，we predict that except the influence of the pathogenicity of different virus，the immune function of NK cells is more affected by the critical clinical symptom in critical condition.

【Key words】NK cells； Coxsackievirus A16； Hand-foot-mouth disease； EV71； Clinical significance

*基金項目：云南省科技計劃青年項目（2012FD100）；云南省衛生科技計劃項目（2014NS052）

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.003

收稿日期：（2015-12-30） （本文編輯：蔡元元）