槲皮素對腎性高血壓大鼠的降壓作用及機制研究

侯國軍，秦小江，侯曉敏，趙曉園，趙良淵

槲皮素對腎性高血壓大鼠的降壓作用及機制研究

侯國軍1，秦小江2，侯曉敏2，趙曉園3，趙良淵2

1.武警太原市支隊衛生隊(太原 030024)；2.山西醫科大學；3.天津大學

摘要：目的探討槲皮素對腎性高血壓大鼠的降壓作用及其機制。方法將30只腎性高血壓大鼠隨機分為3組，每組10只。空白對照組：正常喂養；槲皮素組：正常喂養+槲皮素30 mg/(kg·d)；維拉帕米組：正常喂養+維拉帕米30 mg/(kg·d)。喂養8周，每兩周比較一次3組大鼠的血壓；8周后，采用離體微血管環張力記錄儀，觀察各組大鼠的腎動脈血管環對KCl及生理性刺激劑血栓素A2類似物(U-46619)的收縮反應，并急性分離大鼠腎動脈血管平滑肌細胞，采用激光共聚焦觀察各組大鼠的腎動脈平滑肌細胞對KCl的反應，比較其熒光密度比率。結果膳食補充槲皮素能夠降低腎性高血壓大鼠的血壓，與空白對照組相比，血壓下降了(15.9±3.4)%，差異有統計學意義(P<0.05)；與空白對照組相比，槲皮素組的腎動脈血管環，對60 mmol/L KCl和10-7mol/L U46619的收縮幅度均明顯降低，分別降低了(32.6±4.7)%和(26.8±3.2)%，差異有統計學意義(P<0.05)；與空白對照組相比，槲皮素組的腎動脈血管環平滑肌細胞內的游離鈣離子熒光密度比率下降了(20.4±3.5)% ，差異有統計學意義(P<0.05)。 結論黃酮類化合物槲皮素能降低腎性高血壓大鼠的血壓；其機制與降低腎動脈平滑肌細胞內游離鈣離子濃度有關。

關鍵詞：腎性高血壓；槲皮素；鈣離子；維拉帕米；血管平滑肌細胞

黃酮類化合物槲皮素廣泛分布于植物中，能夠治療多種疾病，如關節炎、細菌感染、哮喘、癌癥等[1-4]。有研究報道，槲皮素能夠舒張離體大鼠的腸系膜動脈、主動脈和冠狀動脈[5-7]，可降低自發性高血壓大鼠的血壓[8]，但對腎性高血壓大鼠的降壓作用卻鮮見報道。本課題通過膳食補充槲皮素，觀察槲皮素對腎性高血壓大鼠的降壓作用，并進一步通過腎動脈血管環和腎動脈平滑肌細胞探討其機制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑槲皮素(純度≥98%)、血栓素A2類似物(U-46619)、EGTA、HEPES、白蛋白、木瓜蛋白酶、二硫丁四醇、膠原蛋白F、膠原蛋白H：均為Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2實驗動物雄性腎性高血壓大鼠30只，體重150g～170 g，購自山西醫科大學實驗動物中心。將動物隨機分為3組，每組10只。對照組給予正常喂養；槲皮素組在正常喂養的前提下，加喂槲皮素30 mg/(kg·d)；維拉帕米組在正常喂養的前提下，加喂維拉帕米30 mg/(kg·d)。

1.3實驗儀器多通道動物無創血壓測量系統：南京德寶生化器材有限公司；微血管張力記錄儀：丹麥DMT公司；激光共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司。

1.4多通道動物無創血壓測量基本實驗程序將清醒狀態的大鼠置于加熱箱內，將尾部固定于連接裝置上，預熱10 min后測量其平均動脈壓，連續測量3次，取其平均值。

1.5離體腎動脈血管環的制備及實驗程序大鼠麻醉后，放血，迅速取其腎臟，置于4 ℃且氧氣飽和的磷酸緩沖鹽溶液(PSS)中。解剖顯微鏡下鈍性分離其腎動脈，找到三級分支，然后剪成長度約為2 mm的腎動脈血管環。將血管環通過兩根直徑為40 μm的鋼絲固定于微血管張力記錄儀上。浴槽內的PSS液維持37 ℃恒溫。調整腎動脈血管環的前負荷到80 mmHg，平衡1 h后開始正式試驗。用60 mmol/L KCl收縮血管環達坪臺，連續刺激血管環3次，當3次的收縮幅度相差不超過10%時，認為血管反應良好，選取收縮張力達到2 mN的腎動脈血管環進行正式實驗。觀察各組大鼠腎動脈血管環對60 mmol/L KCl及10-7mol/L U46619的收縮反應[7，9-10]。

1.6大鼠腎動脈平滑肌細胞分離過程用兩步酶解法分離得到大鼠腎動脈血管平滑肌細胞。先將腎動脈血管環浸入Ⅰ號酶解液：低鈣(0.1 mmol/L CaCl2)的HEPES液，含1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL木瓜蛋白酶和1 mg/mL二硫丁四醇孵育30 min。然后將腎動脈血管環浸入Ⅱ號酶解液：無鈣HEPES液，含有1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL膠原蛋白F和0.5 mg/mL膠原蛋白H，孵育約15 min。用吸管將單個細胞從血管環骨架上輕輕吹打下來，1 000 r/min離心3 min，分離好的腎動脈血管平滑肌細胞用于激光共聚焦實驗。

將細胞用Fluo-4-AM染色，測量加入40 mmol/L KCl 后，3組大鼠腎動脈平滑肌細胞內游離鈣離子濃度。使用激光共聚焦顯微鏡，首先觀察并記錄靜息狀態下離體大鼠腎動脈血管平滑肌細胞的熒光強度，然后用40 mmol/L KCl灌流細胞，記錄當熒光軌跡達到坪臺時的熒光強度。

2結果

2.1槲皮素對腎性高血壓大鼠血壓的影響8周內，空白對照組腎性高血壓大鼠的血壓仍在不斷升高，從開始的163 mmHg±3 mmHg升高到194 mmHg±5 mmHg。槲皮素組8周后大鼠的血壓從165 mmHg±5 mmHg降低到163 mmHg±7 mmHg，與空白對照組相比，8周末的血壓降低了(15.9±3.4)%。維拉帕米組的血壓從164 mmHg±4 mmHg降低到148 mmHg±4 mmHg。詳見圖1。

與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

圖1槲皮素對腎性高血壓大鼠血壓的影響

2.2各組大鼠腎動脈血管環對KCl和U46619的收縮反應60 mmol/L KCl可引起各組腎性高血壓大鼠的腎動脈血管環發生收縮，其最大收縮幅度：空白對照組為4.3 mN±0.8 mN，槲皮素組為2.9 mN±0.4 mN，維拉帕米組為2.7 mN±0.6 mN。槲皮素喂養后，明顯降低了60 mmol/L KCl對大鼠腎動脈血管環的收縮效果，與空白對照組相比，其最大收縮幅度下降了(32.6±4.7)%。詳見圖2。

10-7mol/L U46619可引起各組腎性高血壓大鼠的腎動脈血管環發生收縮，其最大收縮幅度：空白對照組為4.1 mN±0.3 mN，槲皮素組為3.0 mN±0.5 mN，維拉帕米組為2.6 mN±0.4 mN。槲皮素喂養后，明顯降低了10-7mol/L U46619對大鼠腎動脈血管環的收縮效果，與空白對照組相比，其最大收縮幅度下降了(26.8±3.2)%。詳見圖3。

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

圖2KCl對各組腎性高血壓大鼠腎動脈血管環的收縮效果

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

圖3U46619對各組腎性高血壓大鼠腎動脈血管環的收縮效果

2.3加入KCl后各組大鼠腎動脈平滑肌細胞內的游離鈣離子熒光密度靜息狀態下，各組大鼠腎動脈血管平滑肌細胞的熒光強度接近。當用40 mmol/L KCl灌流細胞時，3組大鼠的腎動脈血管平滑肌細胞熒光強度均發生一定程度的升高，當熒光軌跡達到坪臺時，各組細胞的熒光密度比率(F/F0)：空白對照組為2.5±0.1，槲皮素組為2.0±0.2，維拉帕米組為1.5±0.2。與空白對照組相比，槲皮素組腎動脈血管平滑肌細胞內游離鈣離子的熒光密度比率下降了(20.4±3.5)%。詳見圖4。

注：與空白對照組相比，*P< 0.05。

圖3各組腎性高血壓大鼠腎動脈血管平滑肌細胞的

熒光密度比率。

3討論

槲皮素存在于多種水果、蔬菜中，如葡萄、蘋果、沙棘、番茄、洋蔥等，屬于黃酮類化合物。西方人的每日飲食中，大約含有13.82 mg槲皮素[11]。

有研究報道，槲皮素可以降低自發性高血壓大鼠的血壓[8]，本課題中，給腎性高血壓大鼠膳食補充槲皮素，喂養8周期間，大鼠血壓發生了一定程度下降，在喂養8周末，與空白對照組相比，槲皮素組大鼠的血壓下降了(15.9±3.4)%。

為了進一步研究其降血壓機制，本研究觀察了KCl和U46619對3組大鼠腎動脈血管環的收縮效果，發現膳食補充槲皮素組大鼠腎動脈血管環對這兩種收縮劑的反應均發生了一定程度的下降。KCl使細胞膜發生去極化，通過激活L-型電壓依賴性鈣通道引起細胞內鈣離子濃度升高，血管收縮[12-13]。U46619為血栓素A2類似物，可引起腎動脈血管環發生收縮。補充槲皮素后，與空白對照組相比，60 mmol/L KCl對腎動脈血管環的收縮幅度下降了(32.6±4.7)%，10-7mol/L U46619對腎動脈血管環的收縮幅度下降了(26.8±3.2)%。鈣離子通過L-型電壓依賴性鈣通道進入細胞，進而引起動脈發生收縮[14]。激光共聚焦實驗可以反映細胞內的游離鈣離子濃度，本實驗結果顯示，補充槲皮素組的腎動脈血管平滑肌細胞，在加入KCl后，其熒光密度比率低于空白對照組，降低了(20.4±3.5)%。提示膳食補充槲皮素能夠一定程度上降低腎性高血壓大鼠的血壓，其機制與降低細胞內游離鈣離子濃度有關，為了進一步探究其深層次的降壓機制，今后將采用全細胞膜片鉗實驗技術觀察槲皮素對大鼠腎動脈平滑肌細胞膜上相關通道電流的影響。

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(本文編輯郭懷印)

通訊作者：趙良淵，E-mail：sxykdxyxy@126.com

中圖分類號：R544.1R255.3

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．02．009

文章編號：1672-1349(2016)02-0137-03

(收稿日期：2015-06-19)