高通量LAMP檢測常見腸道病原體的可行性分析

疏義林，張雪峰，萬　琴，謝進維 綜　述，張守德審校

(安陸市疾病預防控制中心，湖北孝感 432600)

·綜述·

高通量LAMP檢測常見腸道病原體的可行性分析

疏義林，張雪峰，萬琴，謝進維 綜述，張守德△審校

(安陸市疾病預防控制中心，湖北孝感 432600)

關鍵詞:病原體；LAMP；高通量；分子診斷；傳染性疾病

人類糞-口途徑傳播的病原體主要是病原菌和一些病毒，如志賀菌、沙門菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、彎曲桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌、金黃色葡萄球菌、甲肝病毒、戊肝病毒、輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒等，它們會引起腸道疾病等。人體攜帶這些病原體，是嚴重危害公眾健康的重大問題，也是造成食品和水體污染的間接因素。每年我國發生由病原菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件總數的30%～90%，中毒人數占食物中毒總人數的60%～90%，人們的身體健康受到嚴重危害[1]。目前病毒性肝炎被世界衛生組織(WHO)列為全球第9大引起死亡的疾病，在我國，病毒性肝炎發病數位居法定管理傳染病的第一位[2]。甲型和戊型肝炎病毒，主要通過糞-口途徑傳播，病毒隨糞便排出體外，通過污染水源、食物、食具等傳播途徑造成散發性流行或大流行。針對糞-口途徑傳播的病原體的快速檢測是預防和控制突發性腸道疾病關鍵措施，而目前對病原體檢測主要依靠病原體分離法、免疫方法和核酸擴增及其衍生技術方法，雖然病原體分離是金標準，但操作繁瑣費時；免疫方法敏感性高、操作簡單和快速，但易受到其他物質干擾和抗體特異性差異的影響，從而會導致誤診或漏診；PCR及其衍生技術方法檢測快速、敏感性高和特異性強，已經廣泛應用于一些病原體的檢測，但由于需要特殊儀器設備且操作復雜，導致其不容易在基層單位實驗室推廣應用于病原體檢測。

隨著分子生物學技術不斷發展，不斷產生新的核酸擴增技術。近年來，一種新的恒溫核酸擴增技術，環介導等溫擴增技術(LAMP)已被開發應用，該技術操作簡單、特異性強、靈敏度高、耐受性強，已在病原體快速檢測中得到廣泛應用[3-14]，有望解決突發性腸道疾病的相關病原體的快速檢測的基層應用難題。結合本單位正在開展的LAMP技術檢測甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等病原體的相關研究，對LAMP技術進行介紹和其高通量檢測12種常見腸道病原體的可行性分析。

1LAMP技術簡介

1.1LAMP技術原理LAMP技術是2000年Notomi等[15]人發明的恒溫核酸擴增方法。原理是根據序列保守區域設計的一對外引物和一對內引物特異性識別目標序列上的6個相應區域，在Bst聚合酶的作用下進行自循環鏈置換反應，在60～65 ℃恒溫內，60 min內大量擴增目標DNA片段，可達到109copies以上，同時伴隨副產物白色焦磷酸鎂沉淀的產生。目前，LAMP技術已經發展為普通LAMP、RT-LAMP、實時濁度定量LAMP等。

1.2LAMP技術引物設計LAMP擴增引物包含F3、B3、FIP和BIP引物，能結合目的序列6個不同區域。上游外部引物F3與目的序列F3c 區域互補，下游外部引物B3與目的序列B3c區域互補。上游內部引物FIP，由F2序列和F1c 序列，中間有TTTT連接組成，F2序列與目的序列3′端的F2c 區域互補，F1c 序列與目的序列5′端的Flc 區域序列相同。下游內部引物BIP，由B2 序列和B1c 序列，中間有TTTT連接組成，B2 序列與目的序列3′端的B2c 區域互補，B1c 區域與目的序列5′端的Blc 區域序列相同。引物設計示意圖如圖1。Loop 引物(Loop F，Loop B)是有助于提高靈敏度，縮短反應時間的引物[16]。LAMP技術的關鍵就是引物的設計。應用在線LAMP 引物設計軟件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e)設計引物序列，結合DNAstar 的MegAlign 和Olig6.0對引物分析，避免引物二聚體等產生，再將設計好的引物，在Gene Bank中進行比對，進一步驗證引物的特異性。LAMP 引物設計一般選取一段長約130～300 bp的保守序列作為靶序列。一般引物間距要求：F2的5′端到B2的5′端的距離，最好控制在120～180 bp；F2的前端和F3引物之間以及B2 的前端與B3 引物之間的距離應該在0～20 bp；F2與F1距離和B2 與B1距離保持在40～60 bp。引物的Tm值要求：Tm 主要由模板的GC含量決定，通常Tm 值為60～65 ℃，富含AT區域Tm 值為55～60 ℃，同時引物Tm值應該滿足F2>60 ℃，B2<65 ℃，F3和B3

1.3LAMP反應體系及擴增結果鑒別方法LAMP 反應體系包含了模板DNA、dNTP、Bst DNA聚合酶甜菜堿、緩沖液、引物、Mg2+和ddH2O。通常用25 μL反應體系：模板DNA 1～4 μL，FIP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，Betaine(5 mol/L) 5 μL，MgSO4(250 mmol/L) 0.3～0.8 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，補ddH2O至25 μL，混合后在60～65 ℃保溫15～60 min，然后80 ℃以上加熱2 min 讓Bst DNA聚合酶熱失活，反應終止，或者冰浴終止反應。RT-LAMP反應體系(25 μL):RNA模板3～5 μL、FIP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，MgSO4(250 mmol/L)0.3～0.8 μL，Betaine(5 mol/L)5.0 μL，AMV反轉錄酶(200 U/μL) 0.5 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，補ddH2O至25 μL。產物鑒別方法有瓊脂糖電泳，觀察梯度條帶；在擴增產物中加入SYBR GreenⅠ，反應結果變成綠色說明有擴增產物生成，沒有變色說明無擴增產物生成，注意，在起始反應液中加SYBR Green Ⅰ，會影響到擴增效率；在反應體系中加入HNB，反應結果變藍色說明有擴增產物，紫色說明無擴增產物；在反應體系中加入一種發熒光的螯合劑(鈣黃綠素)，根據有無綠色熒光，肉眼判斷擴增結果；通過對LAMP擴增副產物焦磷酸鎂白色沉淀是否形成來判斷有無擴增，根據反應產生的焦磷酸鎂白色沉淀形成濁度已經開發出一種實時濁度檢測儀，可以用于定量分析。加HNB、鈣黃綠素和觀察濁度方法判斷都可以避免開蓋子檢測。

圖1　　LAMP 引物設計示意圖

2高通量LAMP技術檢測常見腸道病原體的可行性

沙門菌通過標記invA 基因[5]，已經成功鑒別，而且榮研生物科技(中國)有限公司已經推出專門檢測沙門菌環介導等溫擴增法試劑盒。通過LAMP或RT-LAMP擴增志賀菌ipaH基因[17]，彎曲桿菌旋轉酶基因(gyrA)[7]，大腸桿菌O157:H7菌rfbE基因[3]，霍亂弧菌溶血素基因(hlyA)[4]，小腸結腸炎耶爾森菌Ail基因[18]，金黃色葡萄球菌muc基因[19]，輪狀病毒VP7基因[20]，Ⅱ型諾如病毒RNA聚合酶基因[6]，星狀病毒HAstV-2基因[21]，已經成功達到鑒別目的。目前關于甲肝病毒、戊肝病毒有關RT-LAMP技術檢測報道還沒有，但關于甲肝病毒、戊肝病毒分子檢測報道有很多，如RT-PCR[22-23]、熒光定量RT-PCR[24-25]。對甲肝病毒基因組和報道的PCR技術擴增片段分析得知VP1/VP3衣殼蛋白基因的連接區和編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)的3D非結構蛋白基因，它們都具有高度特異性。對戊肝病毒基因組分析得知除ORF1的1 500～3 000堿基有變異外，其他部分特異性和保守性較強，尤其ORF2序列占全部GeneBank序列一半以上，ORF15′端的甲基轉移酶區和ORF13′端的RNA依賴的RNA聚合酶區(RdRP)也比較多。選取甲肝病毒和戊肝病毒特異性保守基因，經Primer Explorer V4軟件設計出多套用于LAMP擴增的引物，經Primer5.0和Olig6.0綜合分析選出幾對基本符合LAMP引物設計要求的引物，將設計好的引物，在Gene Bank中進行比對，保證其特異性。這些引物已經進行初步群體擴增試驗篩選，已經初步篩選出2組較為理想的引物組，后期將進一步對反應體系優化以及對引物調整和修飾，篩選出最理想引物組和反應體系，最后用熒光定量RT-PCR、測序和酶聯方法對其敏感性和特異性進行評估。在同一個水浴鍋或者其他恒溫控制設備中實現12種病原體高通量LAMP擴增檢測，就必須考慮到不同病原體LAMP引物組的Tm值要相近，以便在相同溫度下得到高效率擴增。這12種病原體的引物的Tm通過Nearest Neighor法計算發現基本相近，根據文獻報道和初步試驗發現12種病原體的標記序列在61～65 ℃都可以有效擴增，建議選擇63 ℃進行高通量擴增。在防止污染方面：采用在起始反應體系中加入HNB或鈣黃綠素，避免開蓋子檢測；為進一步防止氣溶膠，在反應液表面滴加礦物油封住液面；為避免上一次擴增產物的污染，可以用dUTP替代dATP，加UGN酶處理反應液后，再進行擴增反應。

3小結與展望

LAMP技術特點:(1)高效性，在恒溫條件下，15～60 min即可完成擴增反應。(2)靈敏性高，比常規PCR高出1～2個數量級，能滿足低拷貝數樣品的檢測，擴增產物靶序列可達到109以上拷貝。(3)特異性非常高，4條特異性引物與目的序列6個區域中任何區域不匹配都不能進行核酸擴增。(4)操作簡單，肉眼直接就可以觀察到擴增結果。(5) 耐受性較高，主要因為Bst DNA聚合酶的耐受性很好，再加上反應緩沖液中的甜菜堿的作用，使LAMP耐受性高于常規PCR很多，因此樣本中一些異物對LAMP反應影響較小，擴增時不需要對樣本進行純化[12]。(6)不需特殊儀器設備，一臺恒溫水浴鍋或者其他恒溫控制設備即可，適合大規模篩查、現場診斷和基層單位實驗室病原體或疾病檢測。但也存在缺點:(1)擴增產物容易產生氣溶膠污染，會造成假陽性。目前已經采用加HNB、鈣黃綠素和觀察濁度等方法避免開蓋子檢測產生氣溶膠污染，在反應液上加封閉液進一步防止氣溶膠擴散出來污染實驗室，采用dUTP替代dATP，加UGN酶處理反應液后，再進行擴增反應，防止上一次擴增產物的污染。(2)引物設計要求比較高，有些基因序列可能不適合使用環介導等溫擴增方法。

隨著LAMP技術、分子標記研究深入和不斷推廣，相關行業已經制定LAMP技術的檢測行業標準。不同款式的LAMP擴增儀的推出使LAMP技術的推廣更加迅速。為了使LAMP技術能更好的運用于基層臨床診斷、現場檢測和即時檢測，必須在擴增穩定性、縮短擴增時間、定量和找到更簡便防止擴增產物污染的檢測方法方面努力。憑借敏感性高、特異性強、耐受性強、操作簡單、檢測結果易判定、成本低廉、適合高通量擴增等優點，LAMP將成為核酸擴增領域的重要技術方法，尤其在病原體快速高通量檢測方面有著推廣價值。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.034

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1385-03

(收稿日期：2015-12-16)