應用實時熒光定量PCR技術(shù)探討B(tài)群鏈球菌與胎膜早破的關(guān)系*1

楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗科，廣東惠州 516003)

·臨床研究·

應用實時熒光定量PCR技術(shù)探討B(tài)群鏈球菌與胎膜早破的關(guān)系*1

楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗科，廣東惠州 516003)

摘要:目的探討應用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)檢測B群鏈球菌與胎膜早破之間的關(guān)系。方法將300例發(fā)生胎膜早破的孕婦設(shè)為研究組，300例未發(fā)生胎膜早破的孕婦設(shè)為對照組，采集孕婦宮頸分泌物，用實時熒光定量PCR法和細菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌。結(jié)果對照組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為7.00%(21/300)；研究組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為20.00%(60/300)。實時熒光定量PCR法檢測B群鏈球菌陽性率為13.50%(81/600)；顯色細菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌陽性率為10.00%(60/600)；傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌陽性率6.67%(40/600)。結(jié)論圍生期孕婦生殖道B群鏈球菌感染與胎膜早破的關(guān)系密切，應加強孕晚期B群鏈球菌的篩查，降低發(fā)生胎膜早破的風險。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測B群鏈球菌的陽性率明顯高于細菌培養(yǎng)法，且用時短，準確度高。盡早檢出B群鏈球菌感染有可能降低或預防胎膜早破的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:聚合酶鏈反應；B群鏈球菌；胎膜早破

B群鏈球菌(GBS)學名為無乳鏈球菌，能引起牛乳房炎，嚴重危害畜牧業(yè)。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該菌也能感染人類，尤其是新生兒，可引起敗血癥、腦膜炎、肺炎等，病死率極高，并可產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，被醫(yī)學界重視。GBS正常寄居于下呼吸道、泌尿生殖道和直腸，帶菌率達30%，健康人的鼻咽部也可分離到GBS。新生兒感染跟母體帶菌有密切關(guān)系，分娩時胎兒可經(jīng)帶菌產(chǎn)道而被感染，也可由醫(yī)護人員呼吸道所帶病菌傳播引起[1]。國內(nèi)文獻報道，圍生期孕婦GBS感染率為3.4%～19.01%，新生兒感染率1.40%～9.95%[2-5]。感染率的不同可能與國家地區(qū)、種族基因、年齡、教育程度、培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)頻率不同有關(guān)。本研究對300例未發(fā)生胎膜早破的孕婦(對照組)和300例發(fā)生胎膜早破的孕婦(研究組)采取3種篩查方式，研究GBS與胎膜早破之間的關(guān)系，旨在盡早篩查出圍產(chǎn)期孕婦的GBS感染情況，以期降低胎膜早破的發(fā)生率?，F(xiàn)將具體過程及結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料將2015年1～8月到本院住院分娩的600例孕婦設(shè)定為研究對象，將發(fā)生胎膜早破的300例孕婦設(shè)為研究組，未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦300例設(shè)為對照組。全部孕婦在自愿并完全了解檢測目的與研究目的的前提下參與本次研究。

1.2儀器和試劑美國ABI7500實時熒光定量PCR擴增儀；上海力申公司HF90/hf240 CO2培養(yǎng)箱；法國生物梅里埃VITEK2-compact分析儀；GBS核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)、陰陽性對照均由福建泰普生物科學有效公司提供；哥倫比亞血瓊脂平板由江門凱林有限公司提供；GBS顯色平板由鄭州安圖生物有限公司提供；馬尿酸鈉生化微量管由杭州天河微生物試劑公司提供；采用金黃色葡萄球菌(ATCC29523)作為質(zhì)控標準菌種，來自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.3診斷標準胎膜早破的定義參照全國高等醫(yī)學院校教材《婦產(chǎn)科學》中有關(guān)診斷定義[6]。孕婦符合下列之一即可診斷為胎膜早破：(1)孕婦自覺有大量液體自陰道流出；(2)酸堿試紙測定陰道分泌物pH>7；(3)陰道液涂片烘干后鏡檢可見羊齒狀結(jié)晶；(4)陰道液沉渣涂片鏡檢可見毳毛。

1.4方法

1.4.1標本采集按照GBS核酸檢測試劑盒標本采集要求，孕婦取膀胱截石位，常規(guī)消毒外陰，滅菌窺陰器擴開陰道暴露宮頸，用棉球擦去宮頸口黏液，分別將3支無菌長棉簽分別插入宮頸口內(nèi)1.5～2.0 cm，轉(zhuǎn)動1圈停留30 s后，取宮頸分泌物置無菌試管中立即送檢。將其中一支按以上方法采集的宮頸分泌物標本按臨床微生物學檢驗常規(guī)方法(以下稱為“傳統(tǒng)培養(yǎng)法”)接種于哥倫比亞血平板進行培養(yǎng)；另一只宮頸分泌物標本接種于B群鏈球菌顯色平板(以下簡稱為“顯色培養(yǎng)法”)進行培養(yǎng)，兩個平板都置于35 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育24 h后觀察血平板上的菌落形態(tài)及β溶血現(xiàn)象和顯色平板的顯色情況，發(fā)現(xiàn)可疑菌落后進行觸酶試驗、CAMP試驗和馬尿酸鈉水解試驗，最后用VITEK2-compact分析儀確證鑒定。

1.4.2實時熒光定量PCR反應檢測將其中一支宮頸分泌物標本按試劑盒要求提取分泌物中細菌的DNA(以下簡稱為熒光PCR法)，上清液用于PCR擴增，在ABI7500 PCR擴增儀上按下列循環(huán)參數(shù)進行擴增反應：stage 1，37 ℃，2 min；stage 2，94 ℃，2 min；stage 3,94 ℃，15 s，55 ℃，45 s；共40個循環(huán)，在stage 3，55 ℃，45 s末端收集熒光，反應體積50 μL。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，3種檢驗方法檢測結(jié)果分別按配對設(shè)計下兩組頻數(shù)分布的χ2檢驗進行比對，對照組和研究組GBS陽性發(fā)生率按完全隨即設(shè)計下兩組頻數(shù)分布的χ2檢驗進行比對。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.13種檢驗方法檢測GBS陽性率比較對照組和研究組共600例產(chǎn)婦中，熒光PCR法GBS陽性數(shù)81例，篩查陽性率為13.50%；顯色培養(yǎng)法GBS陽性數(shù)60例，篩查陽性率為10.00%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法GBS陽性數(shù)40例，篩查陽性率為6.67%。3種檢驗方法檢測結(jié)果兩兩之間GBS陽性率比較采用Fisher精確檢驗，檢驗水準校正為0.017(α=0.05/3=0.017)?？梢哉J為3種方法檢驗出GBS的陽性概率不相等，且熒光PCR法檢測GBS篩查陽性率高于顯色培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.017)。見表1。

2.2對照組和研究組的B群鏈球菌檢測結(jié)果由于熒光PCR法的檢測陽性率和準確率都比顯色培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法要高，所以選用熒光PCR法的檢測結(jié)果作為參考標準。對照組300例產(chǎn)婦中，GBS檢出21株，陽性率為7.00%；研究組300例產(chǎn)婦中，GBS檢出60株，陽性率為20.00%。故發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦的GBS陽性率高于未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦，且差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=27.708，P=0.000)。

表1　　3種GBS檢驗方法結(jié)果比較[n(%)]

3討論

本研究結(jié)果顯示，熒光PCR法檢測GBS的篩查陽性率(13.50%)高于細菌培養(yǎng)法(10.00%和6.67%)，檢測結(jié)果高于王麗等[7]報道的9.40%和5.80%。3種方法在GBS陽性檢出率上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)，且熒光PCR法的陽性檢出率高于細菌培養(yǎng)法。另一方面，熒光PCR法用時短，平均7 h可以完成檢測，而細菌培養(yǎng)法要平均48 h才能完成檢測，可為盡早診斷提供依據(jù)，爭取寶貴的治療時間。

研究結(jié)果顯示，胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為20.00%，未發(fā)生胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為7.00%，本研究結(jié)果低于李小梅等[8]報道的29.59%和11.93%，也低于李曉英等[9]報道的為29.3%和11.7%，可能跟地區(qū)差異、試驗方法，采樣水平等有關(guān)。本研究中，發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦的GBS陽性檢出率高于未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明GBS在生殖道內(nèi)過量繁殖是圍產(chǎn)期孕婦發(fā)生胎膜早破的誘因之一，GBS與胎膜早破的關(guān)系十分密切，完整的胎膜對病原體的入侵具有屏障作用，若胎膜受到感染，往往會導致胎膜早破。在感染的眾多病原體中，由于GBS對絨毛膜的吸附和穿透能力最強，所以危害也最大。寄居在宮頸、陰道、直腸和尿道等處的GBS可上行至胎膜，從而使胎膜感染，并可以通過炎性細胞的吞噬作用和細菌產(chǎn)生的蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部張力降低，從而導致胎膜早破[10-12]。

近年來，世界各地學者對GBS進行大量研究，多數(shù)學者認為GBS與圍生期感染有關(guān)，在孕晚期對所有孕婦進行篩查非常必要。實時熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、準確性好、用時短等特點，適合在醫(yī)院進行GBS的篩查，特別是對于已發(fā)生胎膜早破的孕婦，應盡早完成檢測，及時進行預防性治療。

參考文獻

[1]李凡，徐志凱．醫(yī)學微生物學[M]．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013．

[2]吳海軍，呂磊，宋柳安，等．B群鏈球菌在孕婦及新生兒中的帶菌調(diào)查及耐藥性研究[J]．重慶醫(yī)科大學學報，2013，38(10)：1234-1236．

[3]時春艷，曲首輝，楊磊，等．妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測及帶菌對妊娠結(jié)局的影響[J]．中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45(1)：12-16．

[4]應群華，嚴文衛(wèi)，丁金龍．圍產(chǎn)期生殖道菌群檢測和B群鏈球菌篩查[J]．中國微生態(tài)學雜志，2006，18(6)：491-492．

[5]馬延敏，吳連方，黃醒華，等．孕婦B組溶血性鏈球菌帶菌與母嬰預后的探討[J]．北京醫(yī)學，2005，27(9)：516-518．

[6]樂杰．婦產(chǎn)科學[M]．7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：137．

[7]王麗，葉巍，馬杰．實時熒光 PCR 技術(shù)和細菌培養(yǎng)法檢測妊娠晚期孕婦定植B 群鏈球菌臨床分析[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35(16)：2220-2221．

[8]李小梅，李瑾，袁敏智．用聚合酶鏈反應技術(shù)探討B(tài)群鏈球菌與胎膜早破的關(guān)系[J]．河北醫(yī)學，2011，17(3)：300-302．

[9]李曉英，段純．生殖道B群鏈球菌感染與胎膜早破的關(guān)系及預防[J]．現(xiàn)代護理，2005，11(12)：944-945．

[10]朱敏，范建霞，程利南．圍產(chǎn)期B族鏈球菌感染的研究進展[J]．中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40(2)：137-141．

[11]段濤．B族溶血性鏈球菌感染與妊娠[J]．中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2003，19(12)：705-706．

[12]蘇良香，裴美蘭，張建平，等．B族溶血性鏈球菌感染與胎膜早破及早產(chǎn)的關(guān)系[J]．檢驗醫(yī)學，2007，22(6)：728-729．

△通訊作者,E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn。

*基金項目：惠州市科技計劃項目(20150806)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.035

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1387-02

(收稿日期：2016-01-09)