五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用

馮銳基，龐歡瑛，2*，黃郁蔥，2，簡紀常，2

(1.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088；2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江 524088)

五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用

馮銳基1，龐歡瑛1，2*，黃郁蔥1，2，簡紀常1，2

(1.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088；2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江 524088)

摘要[目的]明確五倍子(Rhus chinenis)、石榴皮(Folium sennae)對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及其生物膜的體外抑制作用。[方法]采用瓊脂擴散法，分別測定五倍子、石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌作用；選用倍比稀釋法確定五倍子、石榴皮對溶藻弧菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)；采用改良微孔板法評價2種中草藥液對溶藻弧菌生物膜形成的影響。[結果] 2種中草藥都有不同程度的抑制溶藻弧菌的作用，五倍子對溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(16.37±0.14)mm，MIC和MBC均為6.25 mg/mL；石榴皮對溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(12.37±0.06)mm，MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL。當藥物濃度在1.56 mg/mL及以上時，五倍子對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用；藥物濃度在6.25 mg/mL及以上時，石榴皮對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。[結論]五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜均有抑制作用。

關鍵詞五倍子；石榴皮；溶藻弧菌；體外抑制作用；生物膜

溶藻弧菌屬于弧菌科弧菌屬，革蘭氏陰性短桿菌，能在有氧或無氧的環境中生長、繁殖，單個存在或尾端相連接形成“S”或“C”形[1]。溶藻弧菌廣泛存在于海水區及河口處[2]，在海水型弧菌中居于首位[3]，能引發魚、蝦、貝、蟹等多種水產養殖動物的疾病，嚴重危害我國水產養殖行業[4]。

細菌生物膜是指由附著于惰性或活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的水合性基質所構成的結構性細菌群落[5]。研究表明，大部分細菌在適宜條件下都可形成生物膜[6]，處于生物膜狀態下的細菌能輕易逃避抗生素和宿主的免疫機制，對細菌病的預防和治療造成困難。目前，關于細菌生物膜防治成為研究熱點。五倍子和石榴皮是常用的中草藥，在防治水產動物疾病中有著廣泛應用。張明等[7]研究發現五倍子對鰻弧菌的抑菌效果顯著，金珊等[8]研究發現石榴皮對哈氏弧菌的抑菌效果較好，但關于這2種中藥對溶藻弧菌及其生物膜抑制作用的研究還鮮見報道。鑒于此，筆者研究了五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用，以期為應用中藥防治由溶藻弧菌引起的弧菌病提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。溶藻弧菌HY9901由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室自廣東省湛江海域患病紅笛鯛(Lutjanuserythopterus)魚體中分離并保存[9]。五倍子、石榴皮購自廣東省湛江春天藥房。

1.1.2主要儀器。-80 ℃超低溫冰箱購自山東省青島海爾公司；SZ-93自動雙重雙蒸水蒸餾器購自上海市亞榮生化儀器廠；自動高壓滅菌鍋(HVE-50)購自日本Hirayama公司；恒溫培養箱購自上海市博迅實業有限公司醫療設備廠；酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3藥劑與試劑。胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)：大豆蛋白胨5.00 g，胰蛋白胨15.00 g，NaCl 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL(調pH至7.2)，高壓滅菌，4 ℃保存。胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)：大豆蛋白胨5.00 g，胰蛋白胨15.00 g，瓊脂粉15.00 g，NaCl 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL(調節pH至7.2)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)的配制：將0.50 g MTT溶于 100 mL磷酸緩沖液(PBS)中，用 0.22 μm濾膜過濾以去除溶液中的細菌，4 ℃避光保存。PBS：Na2HPO41.44 g，NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，KH2PO40.24 g，調pH至7.4，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。0.85%生理鹽水：將0.85 g NaCl用蒸餾水定容至1 000 mL，高壓滅菌后保存。

1.2方法

1.2.1溶藻弧菌的培養。菌株接種在含2%NaCl的TSB中，28 ℃、120 r/min搖床培養18 h。用無菌TSB將菌懸液的密度調至OD600=0.8(約1×108cfu/mL)備用[10]。

1.2.2中草藥水煎液的制備。包括浸泡、煎煮、過濾和濃縮4道工序：稱取中草藥20.00 g，剪碎后放入裝有400 mL蒸餾水的陶瓷鍋中，浸泡約4 h，加熱至沸騰后，改文火煎煮40 min；煎好的中草藥冷卻后立即用8層紗布過濾，藥渣用蒸餾水重復煎煮1次，合并2次濾液；加熱濾液濃縮至20 mL，冷卻后裝于小藥瓶中，制得終濃度為1 g/mL的中草藥水煎液，于4 ℃冰箱保存。

1.2.3藥物體外抑菌試驗。采用瓊脂擴散法。向滅菌的平板內倒入TSA培養基10 mL，冷凝后備用。每種藥液設3個試驗組，分別向平板加100 μL菌液，涂抹均勻，然后用打孔器在每個平板上打3個孔(每孔直徑為6.00 mm，且兩孔距離不小于2 cm)，每孔加入30 μL藥液，另設1個涂有菌液的平板作對照。將平板置于28 ℃培養箱中培養24 h，觀察抑菌效果，并用游標卡尺測量抑菌圈。抑菌效果判定：抑菌圈直徑≥20 mm為強抑菌作用，用“+++”表示；抑菌菌直徑在15～20 mm為中等抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑在10～15 mm為弱抑菌作用，用“+”表示；抑菌圈直徑≤10 mm為無抑菌作用，用“-”表示。

1.2.4MIC的測定。采用倍比稀釋法。試驗組設9支無菌試管，編號為1～9，每支試管加入TSB 2 mL，向1號管加入1 g/mL藥液2 mL，充分混勻后，從1號管中取出2 mL移入2號管，以此類推直至稀釋到9號管，從中吸出藥物混液2 mL，丟棄，再向前7支管各加入菌液20 μL，8號管作為陰性對照管，9號管作為空白對照管。最后將所有管置于28 ℃恒溫搖床上培養24 h。無細菌生長的稀釋管的藥物濃度即為供試藥物對溶藻弧菌的MIC。

1.2.5MBC的測定。從測定MIC的試管中取細菌生長不明顯的試管，從中取100 μL涂布于TSA平板，于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察結果。TSA平板上無細菌生長且含藥液濃度最低管的藥液濃度即為供試藥物對溶藻弧菌的MBC[11]。

1.2.6溶藻弧菌生物膜的形成與定量檢測。采用MTT法[11]。具體步驟：①生物膜培養。將菌懸液按1∶100比例稀釋到新鮮TSB中；將稀釋好的混液以每孔200 μL加入96孔板中，每組設8個重復孔，并設無菌TSB對照孔；在28 ℃濕盒中靜止孵育。②染色。慢慢吸取培養液，用 PBS 緩沖液輕輕洗滌未黏附的菌細胞，吸棄培養基后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，置搖床上低速振蕩 10 min。③定量檢測。用酶標儀測定OD(490 nm)值。各孔OD值與調零孔平均值之差代表各孔生物膜的代謝活性。

1.2.7不同培養時間對溶藻弧菌成膜的影響試驗。溶藻弧菌接種于96孔板后，置于28 ℃濕盒中靜止培養，每隔4～6 h取樣，按“1.2.6”方法測定成膜情況。

1.2.8中草藥液對溶藻弧菌生物膜形成的影響試驗。在無菌條件下，把細菌懸浮液與新鮮TSB按1∶100的比例混合均勻，加入中草藥水煎液，倍比稀釋后，分別上樣200 μL至96孔板中，每組設8個重復孔，并設置陽性對照組[含0.1 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]、陰性對照組(含培養基和菌液)和僅含培養基的空白對照組，28 ℃濕盒中培養24 h，按“1.2.6”方法測定成膜情況。同上述方法設立無菌的藥物對照組。

1.2.9數據處理。應用SPSS Statistics17.0 軟件中的成對樣本t檢驗進行數據統計分析。

2結果與分析

2.12種中草藥的抑菌效果由表1可知，五倍子對溶藻弧菌有中等抑菌作用，石榴皮有弱抑菌作用。

表1五倍子和石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌試驗結果

Table 1Antibacterial effect ofFoliumsennaeandRhuschinenisagainstVibrioalginolyticus

中草藥Chineseherbalmedicine抑菌圈直徑Diameterofinhibitionzone∥mm抑菌效果Antibacterialeffect五倍子Rhuschinenis16.37±0.14++石榴皮Foliumsennae12.37±0.06+

2.2MIC和MBC測定結果由表2可知，五倍子的抑菌效果較好，MIC和MBC均為6.25 mg/mL。石榴皮的抑菌作用較弱，MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL。

表2五倍子和石榴皮對溶藻弧菌的MIC和MBC

Table 2TheMICandMBCofFoliumsennaeandRhuschinensisagainstVibrioalginolyticus

mg/mL

2.3溶藻弧菌生物膜生長曲線由圖1可知，溶藻弧菌生物膜的生長周期：2～4 h為初始定植階段，8～16 h為黏附階段，20～24 h為成熟階段，36 h開始解聚。

圖1　溶藻弧菌生物膜生長曲線Fig.1　Growth cure of Vibrio alginolyticus biofilm formation

2.4不同藥物濃度對溶藻弧菌生物膜形成的影響由圖2可知，與未加藥陰性對照孔相比較，五倍子藥物濃度在0.78 mg/mL及以下時，其對溶藻弧菌生物膜的抑制作用無顯著差異；五倍子濃度在1.56 mg/mL及以上時，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

注：**表示P<0.01Note：** indicated P < 0.01.圖2　五倍子對溶藻弧菌生物膜形成的影響Fig.2　Effects of Rhus chinensis on the formation of Vibrio alginolyticus biofilm

由圖3可知，與陰性對照相比較，石榴皮藥物濃度在3.13 mg/mL及以下時，其對溶藻弧菌生物膜的抑制作用無顯著差異；石榴皮濃度在6.25 mg/mL及以上時，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

注：**表示P<0.01Note：** indicated P < 0.01.圖3　石榴皮對溶藻弧菌生物膜形成的影響Fig.3　Effects of Folium sennae on the formation of Vibrio alginolyticus biofilm

3結論與討論

該研究表明，五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜均有抑制作用。在藥物成分中，當化學鍵振動的波長等于某種細菌的長度時會發生共振，化學鍵的共振有殺菌作用，鞣質中的O-H 鍵波長在很多細菌長度范圍以內[12]。鞣質可凝固微生物體內的原生質及多種酶，對多種細菌、真菌、酵母菌都有明顯的抑制作用。鞣質是五倍子的主要有效成分，研究表明五倍子對多種弧菌具有抑制作用。例如，張曉君等[13]研究了哈氏弧菌對中草藥的敏感性，發現五倍子具有極強的抑菌作用；李忠琴等[14]研究了中藥對鰻鱺病原菌的體外抑制作用，發現五倍子的抑菌作用最強；王玉娥等[15]發現五倍子對溶藻弧菌有明顯的殺菌作用，其MIC、MBC均為1.56 mg/mL。該研究探索了五倍子對溶藻弧菌的體外抑菌作用，結果表明：五倍子對溶藻弧菌有中等抑菌作用(++)，其抑菌圈直徑為(16.37±0.14)mm，MIC和MBC均為6.25 mg/mL；五倍子除了有抑菌作用外還能抑制生物膜的形成，加藥液的成膜量明顯小于未加藥，隨著五倍子濃度的增加其抑制生物膜生長的效果逐漸增強，當五倍子濃度在1.56 mg/mL及以上時，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

現代藥理研究表明，石榴皮中的鞣質、黃酮類化合物是其抗菌的活性組分[16]。陳霞等[17]對47種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效試驗結果表明石榴皮的抑菌和殺菌效果最好。梁利國等[18]發現石榴皮對鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍亂弧菌等細菌具有較好的抑菌和殺菌作用。該研究探索了石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌作用，結果表明：石榴皮的抑菌效果為弱抑菌(+)，抑菌圈直徑為(12.37±0.06)mm，其MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL；石榴皮除了抑菌作用外還能抑制生物膜的形成，石榴皮濃度在6.25 mg/mL及以上時明顯抑制了生物膜的生長。

該試驗證明了五倍子和石榴皮這2種中草藥對溶藻弧菌的游離菌及其生物膜形成具有抑制作用，對致病性弧菌引起的水產動物疾病防治具有參考意義。但該試驗是在細菌相對穩定的生長環境中進行的，并未考慮到環境和用藥方式等對藥效的影響，具有一定的局限性，今后應在養殖環境和用藥方法方面進行綜合研究。此外，雖然中草藥以其資源豐富、天然綠色、高效低毒、抗藥性不顯著且兼有藥物性和營養性的特點而廣泛應用于各種水生經濟動物疾病的預防和控制，并取得了一定的成果，但目前中草藥防治魚病的知識和經驗尚不能滿足生產上的需要，國內外相關研究較少，并且中草藥的有效成分復雜，其類型、含量受遺傳因素、外界環境、地域性和季節性影響較大，分子結構難以鑒定，今后既要研究漁用中草藥的主要成分和功效，又要廣泛開展應用研究，篩選出防治效果理想的中草藥配方，從而達到標本兼治的目的。

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Inhibitory Activity ofRhuschinenisandFoliumsennaeonVibrioalginolyticusand Its Biofilm

FENG Rui-ji1, PANG Huan-ying1，2*, HUANG Yu-cong1，2et al

(1. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang, Guangdong 524088)

Abstract[Objective] To detect the inhibitory effects of Rhus chinenis and Folium sennae on Vibrio alginolyticus and its biofilm. [Method] The inhibitory effects of R. chinenis and F. sennae on V. alginolyticus were tested by agar diffusion method. The MIC and MBC were detected by the double dilution; the effects of R. chinenis and F. sennae on V. alginolyticus biofilm were measured by improved micro plate method. [Result] Two species of Chinese herbal medicines had different degrees of inhibition. R. chinenis had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone (DIZ) of (16.37 ± 0.14) mm, and the MIC and MBC were 6.25 mg/mL; F. sennae had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone (DIZ) of (12.37 ± 0.06) mm, and the MIC and MBC respectively were 12.50 and 25.00 mg/mL, respectively. Both R. chinenis and F. sennae exhibited a potent inhibitory activity against V. alginolyticus biofilm formation. [Conclusion] R. chinenis and F. sennae can significantly inhibit V. alginolyticus and its biofilm.

Key wordsRhus chinenis; Folium sennae; Vibrio alginolyticus; In vitro inhibitory activity; Biofilm

基金項目廣東省教育廳基礎研究重大培育項目(2014GKXM046)；廣東高校國際合作創新平臺項目(2013gjhz0008)；廣東海洋大學創新強校項目(GDOU2015050216)。

作者簡介馮銳基(1990- )，男，廣東肇慶人，本科生，專業：水產養殖。*通訊作者，副教授，博士，從事水產經濟動物病害研究。

收稿日期2016-03-15

中圖分類號S 941.43

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-001-03