內生真菌產植物次生代謝產物研究進展

牛麗麗，袁肖寒，顧成波*，劉紫薇，馬 慧，寧文娟

(1.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北農業大學生命科學與生物技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

內生真菌產植物次生代謝產物研究進展

牛麗麗1，袁肖寒2*，顧成波1*，劉紫薇1，馬 慧1，寧文娟1

(1.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北農業大學生命科學與生物技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

摘要概述了宿主植物與內生真菌的關系，總結了內生真菌次生代謝產物結構及生物活性多樣性，重點分析了內生真菌規模化生產高價值植物次生代謝產物存在的問題及解決策略，并展望了未來發展方向。

關鍵詞內生真菌；代謝產物；生物活性；共培養；表觀遺傳

內生真菌是指在其生活史的一定階段或者全部階段生活于健康植物各種組織和器官的細胞間隙或細胞內部的真菌，且被感染的宿主植物并不表現出明顯的病害癥狀。所有植物種類(包括非維管束植物、蕨類、松柏類和被子植物在內)都被認為和內生真菌是共生關系[1]。內生真菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，目前預測的100萬種(或更多)內生真菌中僅有一小部分得到分離培養[2]。

內生真菌的重要意義在于其提供了替代性策略，減少了對生長緩慢的珍稀植物的需求，有助于保持地球逐漸減少的生物多樣性，而且微生物源高價值植物化學成分的開發相對更容易和經濟，增加了產品可得性并降低了價格。內生真菌的“生物勘探”對發現植物相關次生代謝產物及其類似物以及有治療用途的新型先導化合物(及其合成修飾)具有重要意義。目前，針對內生真菌的大多數研究集中于篩選能產生新穎或已知高價值的生物分子，但探究這些生物體內新穎的次生代謝產物的產生機制報道較少。通常由基因模塊或操縱子編碼的次生代謝產物的大規模生物合成的主要障礙在于包括分子水平的調控機制仍有待于全面研究，特別是參與內生真菌植物次生代謝產物生物合成起始和調控的主要深層分子機制。鑒于此，筆者概述了宿主植物與內生真菌的關系，總結了內生真菌次生代謝產物結構及生物活性多樣性，重點分析了內生真菌規模化生產高價值植物次生代謝產物存在的問題及解決策略，旨在為利用內生真菌生產高價值植物次生代謝產物提供參考。

1植物與內生真菌的相互作用

自然生態系統中的所有植物都可與內生真菌共生，內生真菌已成功適應宿主的免疫系統，在宿主植物的內部組織內形成種類繁多的微生物群體。這些高度多樣性的真菌群對植物群落具有重要意義。內生真菌群體間及其與宿主的交流對植物的生理過程具有重要影響(包括植物代謝產物的生物合成)。在脅迫條件下內生真菌可顯著影響宿主表現[3]。內生真菌可能會通過精密改變植物對環境變化的反應，調節植物微生態系統的運行[4]。內生真菌通過賦予植物對生物和非生物脅迫的耐性，如通過增加生物量及降低水分消耗以增加植物的適應性，也能通過改變資源分配來降低宿主適應性。

微生物可能會感知來自植物的任何應激誘導的分子，并且當植物處于某種脅迫狀態(如病原菌侵襲)時，存在于植物和微生物內的同源基因簇可能會被交叉激活[5]。宿主遺傳因子可能也會顯著影響與植物相關的微生物的結構和功能[6]。深入探討內生真菌與宿主之間的相互作用，有目的性地構建新的內生真菌共生體及植物微生態系統具有十分重要的研究意義。

2內生真菌代謝產物

作為隱藏在宿主植物體內的微生物倉庫，其發酵產物具有豐富的化學結構多樣性和廣泛的生物活性。內生真菌是具有醫藥活性和農業應用潛力新穎化合物的豐富來源。當首次發現紅豆杉屬內生真菌Taxomycesandreanae能產生紫杉醇后，科學家把尋找新藥源的重點從植物轉向了內生微生物上。表1介紹了一些內生真菌產生的宿主植物來源的重要次生代謝產物。

3內生真菌代謝產物生物活性多樣性

3.1抗癌活性內生真菌抗癌活性的研究起源于Strobel從短葉紅豆杉中分離出來的紫杉醇產真菌Taxomycesandreanae，臨床上紫杉醇具有顯著治療卵巢癌和乳腺癌的生物活性。

從假柴龍樹中分離得到的內養囊霉屬內生真菌Entrophosporainfrequens含有生物堿物質，對人類肺癌、肝癌和卵巢癌均顯示強效抗腫瘤活性[43]。

表1　內生真菌合成的一些代謝產物

從茶茱萸科植物中分離得到含喜樹堿的2種內生真菌，其發酵產物對結腸癌和卵巢癌細胞毒具有明顯作用[44]。從泰國的4個森林中分離得到582株內生真菌，有60株具有抗人類口腔表皮樣癌細胞作用和48株對乳腺癌細胞有抑制作用[45]。

從印度植物牛油果的葉分離得到可產生麥角黃素的內生真菌，是一種新型的抗癌劑。內生真菌GliocladicillinsA和B在體外和體內均可作為有效的抗腫瘤制劑，它們能誘導腫瘤細胞的凋亡并且能夠抑制黑色素瘤的增值[46]。

3.2抗菌活性內生真菌產生具有抗菌活性的萜類主要有倍半萜、二萜和三萜。從白花牛角瓜中分離得到6株內生真菌顯示對人類致病性的微生物和植物病原真菌具有抗菌活性，其中抗細菌活性要強于抗真菌活性，分離得到的蒼白彎孢菌對包括革蘭氏陰性菌、金黃色葡萄球桿菌、化膿鏈球菌等均產生抑制作用[47]。

從皇冠花的葉中分離得到的166株內生真菌中，發現有33株至少對煙草赤星病毒、尖孢鐮刀菌、葡萄孢菌和腐霉屬菌4種植物病原真菌的1種具有抗菌作用，其中毛殼屬(Chaetomium)內生真菌抗菌活性最強[48]。

從咖啡樹中分離得到17株內生絲狀真菌對人類致病菌包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和4種不同血清型大腸桿菌具有抗菌活性，是潛在的特效抗菌劑[49]。

3.3殺蟲活性香莢蘭屬植物中分離得到內生真菌Phomopsisarcheri，其產生的芳香倍半萜烯類物質對惡性瘧原蟲具有顯著的殺蟲活性[16]。內生真菌Aspergillusterreus的發酵液中分離得到的丁內酯類化合物具有抗瘧疾活性[50]。

從藥用植物醉馬草中分離出2種內生真菌Clavicepspurpurea和Clavicepschaetomium，該2種內生真菌對棉蚜蟲具有顯著的抗蟲活性[51]。具有殺蟲活性的樟腦是從1株藤本植物的內生真菌Muscodorvitigenus中分離鑒定出來的，樟腦球被作為殺蟲劑而廣泛使用。

從九里香中分離內生真菌Eupenicilliumsp.，其次生代謝物中含有的化學成分具有顯著的殺蟲活性[52]。黑云杉中分離出的內生真菌Canopleaelegana發酵液中含有2種對云杉蚜蟲具有明顯毒性的異香豆素。

3.4抗病毒活性在索諾蘭沙漠植物橡木中分離得到的鏈格孢屬內生真菌Alternariaalternata在抗艾滋病病毒的檢測中顯示有顯著的抗病毒活性，其含有的環氧二萘嵌苯結構骨架可被操縱產生強大的抗HIV病毒的活性物質[53]。

從七葉蘭的葉子中分離得到內生真菌Diaporthesp.產生2種新的苯駢吡喃酮類物質，能夠抑制結核分枝桿菌毒性菌株的生長，從而達到抗結核病的作用。分離自內生真菌PestalotiopsisficiW106-1的5個結構新穎的環丙烷衍生物(Pestafoficiols A～E)具有抑制對HIV-l病毒在細胞株C8166中復制的活性[54]。

3.5抗炎活性通過深層發酵培養內生真菌腐皮鐮刀菌FusariumsolaniSD5，獲得了胞外多糖，有體外抗炎活性和抗過敏活性[55]。對50株溫郁金內生真菌發酵產物進行抗炎活性篩選，發現其中5株具有極顯著的抗炎活性[56]。

3.6免疫調節活性內生真菌擁有生產新化合物的能力，是潛在的免疫調節活性物質，這些免疫調節化合物主要分為免疫抑制劑和免疫調節藥物。從雷公藤內生真菌Pestalotiopsisleucothes中分離得到3種化合物，該3種化合物在高濃度的條件下能改變T淋巴細胞亞群內的百分比，并且在這類化合物的免疫抑制濃度下，細胞活力并未受到影響[15]。

3.7抗氧化活性抗氧化劑是能保護細胞免受不穩定分子如自由基破壞的物質，自由基介導的反應與退行性疾病如癌癥、阿爾茨海默病等有關，目前，僅有少數抗氧化劑得到臨床批準。

從木豆葉中分離得到內生真菌MD-R-1，發現內生真菌乙酸乙酯粗提物有較好的抗氧化活性[57]。從烏墨蒲桃中分離得到21株內生真菌，均具有抗氧化活性，其中9株內生真菌具有顯著抗氧化活性[58]。

3.8促進植物生長活性感染內生菌的宿主植物比未感染植株往往具有生長快速、抗逆境、抗病害等優勢。從美花石斛中分離出來的鐮刀菌屬(Fusarium)和棘殼孢屬(Pyrenochaeta)內生真菌在樹皮腐殖土培養基中能夠促進植物生長[59]。被特殊內生菌寄生的植物，由于內生菌產生的激素，通常生長更快，更有競爭力，并在特定環境中占優勢地位。

內生真菌也能產生生理活性物質赤霉素。內生真菌對植物的生長的有益作用對于農業生態系統十分重要。因為它們在補償環境擾動時，減少了對化肥的需求，降低了土壤和水污染。赤霉素產生菌與農作物的共生是克服生物脅迫的不利影響的一個有前景的策略，不但增加植物生物量而且改善了在極端環境條件下的植物生長。

3.9其他生物活性 擬莖點霉屬內生真菌PhomopsisliquidambariB3生產漆酶，并且通過優化培養條件使漆酶的產量大大增加。從厄瓜多爾北部的蘭科植物中分離得到1種內生真菌Phomopsissp.，這種內生真菌可分泌只有在高等植物中存在的揮發性有機化合物檜烯類物質[60]。

狹葉南五味子的134種內生真菌中，有39個變種具有非凡的生物催化功能，它們屬于鐮刀菌屬、青霉菌屬、栓菌屬、木霉屬等多個種屬[61]。

從藥用植物柳杉葉馬尾杉中分離得到2株能夠產生石杉堿甲的內生真菌，分別是芽孢菌屬的HA15和葡萄孢屬的HA23。在一定的優化條件下，石杉堿甲的含量大大提高，其含有的中樞乙酰膽堿酯酶具有高效、可逆、高選擇性的抑制作用，可用于阿爾茨海默病的治療[62]。

4持續提高內生菌次生代謝產物產量的策略

雖然內生真菌能產生高價值的化合物，但應用這些菌株生產高價值的植物化學品仍未取得突破。目前，對無菌培養條件下傳代培養的內生菌產量逐漸下降的問題已有廣泛共識，成為其生物工藝商業化的主要限制之一。

為實現和完全挖掘能滿足工業規模產量的內生真菌次生代謝產物，需要通過必要的菌株改良技術如內生真菌誘變、遺傳轉化等方法，開發高產量內生菌菌株，使該菌株能在商業化可行的水平上合成次生代謝產物；改良的菌株能夠經過各種微生物發酵生物工藝優化策略，如優化發酵參數、添加誘導子和抑制子、前體飼喂、利用吸附樹脂/固相載體等，進一步提高次生代謝產物的產量和生產力。

雖然在很多情況下，對無菌培養條件下內生真菌應用生物過程優化策略已增加了產品產量，但通常無菌培養條件下內生菌的基因組不穩定或生物合成基因沉默阻礙了將新分離的菌株用于生物工藝開發的嘗試。因此，還要通過其他有效策略(如共培養和表觀遺傳修飾)應對無菌培養條件下穩定并提高內生真菌生產能力相關的挑戰。圖1顯示了一個無菌培養條件下開發內生真菌次生代謝產物的合理策略。

共培養或混合培養發酵是提高內生菌次生代謝產物產量的一種重要策略。通過設計新型共培養體系，模擬宿主體內微環境，提供給內生菌在植物體內同種類型的促進其繁殖的選擇壓，提高內生菌體內與宿主關聯的次生代謝產物及新型次生代謝產物。不同菌種在共培養期間所經歷的競爭或拮抗作用可能會使在無菌培養條件下選擇菌株原有化合物產量顯著提高，或使以前未被檢測到的某種(些)神秘化合物產量得到累積。

真菌生物合成基因簇經常位于染色體的遠端區域，以異染色質狀態存在。這些基因經常被表觀遺傳調控轉錄控制，如組蛋白去乙酰化及DNA甲基化。應用組蛋白脫乙酰化及DNA甲基化操作來修飾染色質，從而調控真菌和其他生物體內的基因表達或基因沉默。因此，可以利用表觀修飾(如DNA甲基轉移酶和組蛋白脫乙酰酶抑制劑)來誘導染色質重建，作為破解神秘生物合成基因簇的策略。

圖1　無菌培養條件下內生真菌次生代謝產物開發的合理策略Fig.1　The rational strategy toward the exploitation of endophytic fungi secondary metabolites under axenic culture

5展望

內生真菌研究的真正意義不僅在于其生態獨特性，更在于微生物在宿主體內和宿主植物的協同作用及協同作用所產生的新功能和新物質。未來將內生真菌開發為植物次生代謝產物的體外生產平臺，應加強以下幾個方面的研究：

(1)借助遺傳工程、發酵工程、代謝工程等組合方法，通過各種生物過程優化策略，保持并提高內生菌中高價值的植物次生代謝產物產量。

(2)探索內生真菌內基因沉默的原因，利用混合培養或表觀遺傳修飾等各種策略激活沉默基因簇的表達來提高無菌培養條件下內生真菌有效成分的產量。

(3)應積極利用包括生物信息學、分子生物學、分子遺傳學等跨學科的方法組合，探索在絲狀真菌內起作用的、有利于重要先導分子規模化合成的主要調控元件。

(4)各種生物選擇壓(如病原菌、動物取食等)和非脅迫因子(如植物/內生真菌次生代謝產物的前體及環境條件)可能對內生真菌產生某種高價值天然產物都存在影響。因此，深入了解內生菌與其宿主植物及其他相關生物(真菌、細菌或病毒)和內共生體在雙邊、三邊及多邊的相互作用，對內生真菌天然代謝產物的合成具有重要研究意義。

(5)相對于內生真菌次生代謝產物，還缺少對內生真菌生物學、生理學和分子及化學生態學方面的系統了解，加強對這些方面的認識，有利于進一步開發內生真菌的潛在應用價值。

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Research Progress on Secondary Metabolites Produced from Endophytic Fungi

NIU Li-li1, YUAN Xiao-han2*, GU Cheng-bo1*et al

(1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. Life Science and Biotechnique Research Center, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

AbstractThe review outlined the relationship between the host plants and endophytic fungi, and summarized the structures and biological activities of secondary metabolites from endophytic fungi, then highlighted the problems of large-scale production of high value plant secondary metabolites from endophytic fungi and their solving strategies. In addition, it prospected the direction of future development.

Key wordsEndophytic fungi; Metabolites; Biological activities; Co-culture; Epigenetic inheritance

基金項目中央高校基本科研業務費專項(DL13CA02，2572014EA02-3)。

作者簡介牛麗麗(1990- )，女，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，研究方向：植物內生真菌的篩選及其活性代謝產物。 *通訊作者，袁肖寒，助理研究員，博士，從事天然植物資源開發利用研究；顧成波，副教授，博士，碩士生導師，從事植物內生菌資源開發利用研究。

收稿日期2016-03-06

中圖分類號Q 938

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-012-05