草魚出血病分子流行病學及GCRV多樣性研究

黃毅昌，雷 燕，楊玉滔，閆秀英*，簡紀常，吳灶和

(1.廣東海洋大學水產學院，廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室/水產經濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東湛江 524088；2.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東廣州 510515)

草魚出血病分子流行病學及GCRV多樣性研究

黃毅昌1，雷 燕2，楊玉滔1，閆秀英1*，簡紀常1，吳灶和1

(1.廣東海洋大學水產學院，廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室/水產經濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東湛江 524088；2.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東廣州 510515)

摘要[目的]分析不同基因型GCRV分離株與患草魚出血病草魚癥狀的相關性。[方法]采用RT-PCR檢測患病草魚，應用生物信息學方法分析基因型內和基因型間不同分離株間的差異。[結果]對近3年來草魚出血病分子流行病學分析發現，患草魚出血病病魚多為“腸炎型”癥狀，且檢測發現其病原多屬于GCRV基因型Ⅲ型。對GCRV的多樣性分析表明，不同分離株同源蛋白的同源率高達93%以上，卻被給予完全不同的名稱，給GCRV多樣性研究帶來一定的困難；同一基因型不同分離株同源蛋白間的變異位點較少，且功能位點發生變異的更少；不同基因型不同分離株同源蛋白間的保守位點較少，且這些保守位點中只有極少數位點為功能位點；不同基因型分離株同源結構蛋白間存在較大的差異，且同源非結構蛋白間的差異更為顯著。[結論]草魚出血病不同臨床癥狀可能與其病原基因型不同有關。

關鍵詞草魚呼腸孤病毒；草魚出血病；分子流行病學；多樣性

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水養殖的主要經濟魚類之一，但草魚出血病給草魚養殖業造成了嚴重的經濟損失[1]。根據患病草魚出血部位的不同，草魚出血病的癥狀可分為3大類型：“紅肌肉型”、“紅鰭紅鰓蓋型”和“腸炎型”[2]。迄今為止，對草魚出血病及其病原草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus)的研究已取得很多突破性進展[3-6]。草魚呼腸孤病毒是分節的dsRNA病毒，具有11個基因節段，且有些分離株間存在較大的差異[4]。不同的選擇壓影響著病毒的演化[7]，目前已分離到多株GCRV分離株，發現已有的GCRV分為4種基因型，在我國分布有3種基因型[8-10]。

控制草魚出血病的發生、減少草魚出血病發生率、降低患草魚出血病草魚死亡率以及提高草魚出血病疫苗的免疫效果是目前從事水產養殖業者關心的主要問題。對草魚出血病及其病原的研究可為降低草魚養殖業的損失奠定基礎，但因為草魚出血病引起的草魚死亡率仍然較高，病原多樣性是影響因素之一[5，11]。根據已有的研究和提交至GenBank數據庫的基因序列及近年來草魚出血病的癥狀分析表明，近幾年發現的分離株多為以GCRV HZ08為代表的基因型Ⅲ型分離株，且草魚出血病的癥狀多為“腸炎型”。因此，推測草魚呼腸孤病毒的多樣性可能與其引起的疾病癥狀相關，深入研究草魚呼腸孤病毒的多樣性對草魚出血病的流行及防控治療有著重要意義。廣州利洋水產科技股份有限公司于2012～2015年對草魚出血病分子流行病學進行了調查，筆者通過對GCRV基因組和蛋白多樣性及蛋白特性進行分析，探討GCRV多樣性與草魚出血病臨床癥狀及GCRV致病機理的相關性，旨在為深入研究GCRV的致病機理、蛋白功能及草魚出血病的防控等奠定基礎。

1材料與方法

1.1草魚出血病分子流行病學調查2012年4月至2015年6月，在我國各地草魚養殖區采集患出血病的草魚，檢查并記錄出血病的臨床癥狀，同時應用RT-PCR方法對其病原GCRV進行檢測，并對獲得的目的片段進行測序。RT-PCR檢測的GCRV目的基因為vp2基因，目的片段長度為413 bp，PCR所用引物為UP1(5′-GTTCCTGTCGTGGCTGGTATC-3′)和DW1(5′-GGTAGCTTAGAGTTCCTATCA-3′)、UP2(5′-GTCCCACTCACTGCCGGTATG-3′)和DW2(5′-GGGATTTTCGTGAAGGTTGTCT-3′)。PCR反應體系(25 μL)如下：ddH2O 16.5 μL、cDNA(約25 ng)2 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、10×ExTaqBuffer 2.5 μL、ExTaq酶(1 U/μL)0.125 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。將電泳產物純化回收后與pMD18-T載體連接，轉化至大腸桿菌 DH5α菌株，篩選陽性克隆并送至上海生工生物有限公司測序鑒定。

所獲得的檢測毒株序列與已知的GCRV序列進行比對，然后使用MEGA軟件構建最大簡約樹(MP)、最大似然樹(ML)和鄰接樹(NJ)，Bootstrip值設為1 000。

1.2GCRV基因組多樣性分析從GenBank數據庫中下載已知的GCRV分離株基因組序列，應用DNAStar軟件分析各分離株的同源性，進而分析GCRV基因組多樣性。

1.3GCRV Ⅲ型基因型分離株蛋白的變異特性目前已知GCRV Ⅲ型基因型分離株基因組和基因序列最多，在已知的GCRV基因組中有9株GCRV分離株屬于Ⅲ型基因型，1株分離株(GCRV-873)屬于Ⅰ型基因型，1株分離株(GCRV 104)屬于Ⅳ型基因型。為探討GCRV的多樣性與GCRV的進化，多樣性包括基因型間的多樣性和基因型內的多樣性，同時為了深入探討GCRV基因型和GCRV蛋白作用位點與疾病癥狀的關聯，對已知的GCRV Ⅲ型基因型分離株(GCRV 106、GCRV JX02、GCRV 918、GCRV 794、GCRV 109、GCRV Henan988、GCRV HZ08和GCRV GD108)蛋白變異特性進行分析。使用DNAStar排列相關氨基酸序列，并統計相應同源蛋白的變異位點。

1.4GCRV HZ08蛋白相互作用基序分析使用iLIR軟件(http：//repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR/)對HZ08分離株的蛋白質氨基酸序列進行相互作用基序分析。

1.5GCRV HZ08蛋白糖基化位點、金屬及二硫鍵結合位點分析使用NetOGlyc軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別對HZ08的各個蛋白質進行O-連接糖鏈的連接位點預測，得到上述蛋白質潛在的糖基化位點。使用METALDETECTER軟件對上述蛋白質進行金屬結合位點預測，得出其金屬結合位點與二硫鍵結合位點。

1.6GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白相互作用位點分析利用蛋白質三維結構數據庫Protein Data Base獲取GCRV-873的VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的三級結構數據，并結合基于序列特征的不同殘基溶劑可及性的SPPIDER方法，使用SPPIDER在線數據庫(http：//sppider.cchmc.org/)對上述蛋白質進行蛋白互作位點預測。

1.7不同基因型代表株VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的保守位點分析以GCRV 873、GCRV HZ08和GCRV 104分別為基因型Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型的代表株，使用DNAStar排列相關的氨基酸序列，分析此3株分離株蛋白的保守位點。

1.8GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結構預測使用蛋白質數據庫(Protein Data Bank)查詢到的GCRV 873分離株的VP1、VP3、VP5和VP6蛋白的PDB文件[12]，預測其3D結構。

2結果與分析

2.1草魚出血病分子流行病學調查情況廣州利洋水產科技股份有限公司水產動物疾病研究所于2012年4月至2015年6月從我國各地草魚養殖區采集疑似患出血病的草魚440例，檢測結果表明其中288例草魚出血病病毒呈陽性，此288例分布于山東、河南、湖北、湖南、天津、河北、廣東、福建、山西等省份。檢測出草魚出血病病毒陽性的草魚都具有腸道發紅的癥狀，偶爾具有紅肌肉的癥狀，未見到紅鰭紅鰓蓋的癥狀。利用PCR方法檢測到目的片段并進行測序，序列比對結果表明患出血病草魚均檢測出GCRV。同時，對檢測到的毒株進行親緣關系分析，使用MEGA所構建多種系統樹的拓撲結構基本一致。從圖1可以看出，所檢測的毒株(GCRV-Tianjin、GCRV-Guangdong、GCRV-Hubei、GCRV-Qingyu)與GCRV HZ08親緣關系最近。

注：括號內為已知GCRV分離株vp2基因的GenBank編碼。數字為置信度。Note：GenBank codes of the vp2 genes in GCRV isolates are in brackets.Numbers are the confidence.圖1　部分檢測GCRV分離株的系統發生分析Fig.1　Analysis on the phylogency of some detected GCRV isolates

2.2GCRV基因組多樣性分析從GenBank數據庫中下載了GCRV 873、AGCRV、GCRV 106、GCRV Henan988、GCRV Hunan794、GCRV JX02、GCRV HZ08、GCRV 918、GCRV GD108、GCRV 109和GCRV 104基因組序列(表1)，基因組序列GenBank編碼分別為KC201166～KC201187、AF403390～AF40 3397、GQ896334～GQ896337、GU350742～GU350748、HQ231198～HQ231208、KC238676～KC238686、KC847320～KC847330、KF712475～KF712485、KM880065～KM 880073、NC_010584～NC_010594、JQ042805～JQ042808、AF260511～AF2605113、HQ018818和JN967629～JN967639。Ⅰ型基因型代表株GCRV 873、Ⅲ型基因型代表株GCRV HZ08和Ⅳ型基因型代表株GCRV 104相應蛋白相似性分析見表2。

2.3GCRV Ⅲ型基因型分離株蛋白的變異特性分析GCRV 106、GCRV JX02、GCRV 918、GCRV 794、GCRV 109、GCRV Henan988、GCRV HZ08和GCRV GD108編碼的蛋白變異特性。從圖2可以看出，GCRV基因組片段1編碼的VP1間的同源率為99.1%～99.8%，變異位點有39個氨基酸位點；片段2編碼的VP2間的同源率為98.0%～99.8%，變異位點有60個氨基酸位點；片段3編碼的VP3間的同源率為97.2%～99.0%，變異位點55個個氨基酸位點；片段4編碼的NS1或NS79間的同源率為97.9%～99.7%，變異位點有21個個氨基酸位點；片段5編碼的VP5間的同源率為97.8%～99.4%，變異位點有31個氨基酸位點；片段6編碼的VP4間的同源率為98.2%～100%，變異位點有22個氨基酸位點；片段7編碼的NS4或VP56的同源率為93.4%～99.8%，變異位點有44個氨基酸位點；片段8編碼的VP6間的同源率為97.1%～100%，變異位點有28個氨基酸位點；片段9編碼的NS2間的同源率為97.5%～99.4%，變異位點有25個氨基酸位點；片段10編碼的VP38或NS38間的同源率為99.1%～100%，變異位點有5個氨基酸位點；片段11編碼的VP35或VP11間的同源率為97.4%～100%，變異位點有11個氨基酸位點。

注：*表示此行數據為該片段長度(bp)/基因長度(bp)/編碼蛋白及其長度(aa)。

Note：* stands for that data in the line is the segment length(bp)/the gene length(bp)/the encoded proteins and their length(aa).

表2Ⅰ型基因型GCRV 873、Ⅲ型基因型GCRV HZ08和Ⅳ型基因型GCRV 104相應蛋白的相似性分析

Table 2Similarity analysis of homologous proteins in GCRV 873 attibuted to genotype Ⅰ，in GCRV HZ08 attibuted to genotype Ⅲ and in GCRV 104 attibuted to genotype Ⅳ

GCRV873與GCRVHZ08GCRV873GCRVHZ08同源率Homologousrate∥%GCRV873與GCRV104GCRV873GCRV104同源率Homologousrate∥%GCRVHZ08與GCRV104GCRVHZ08GCRV104同源率Homologousrate∥%VP1VP128.3VP1VP128.7VP1VP126.7VP2VP245.4VP2VP242.1VP2VP243.0VP3VP335.3VP3VP334.8VP3VP335.3NS1NS7915.2NS1VP6616.7NS79VP6615.6VP5VP523.1VP5VP520.6VP5VP518.0VP4VP430.6VP4VP425.7VP4VP423.7VP6VP619.4VP6VP619.2VP6VP616.5NS2NS3813.3NS2VP1515.0NS38VP1512.9VP7VP4112.7VP7VP3912.0VP41VP3911.9NS4/NS5VP5615.0NS4/NS5VP5512.8VP56VP5512.9NS3VP3512.3NS3VP3811.1VP35VP3811.3

圖2　GCRV蛋白特性分析Fig.2　Analysis on the characterizations of GCRV proteins

2.4GCRV HZ08蛋白互作基序分析以GCRV HZ08為代表，分析其蛋白互作基序。從圖2可以看出，VP1、VP2、VP3、NS79、VP5、VP4、VP56、VP41、VP6、NS38和VP35分別有168、156、120、66、90、60、42、36、78、24和30個氨基酸位點位于蛋白互作基序。

2.5GCRV HZ08蛋白糖基化位點、金屬及二硫鍵結合位點分析通過預測發現VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、NS79、VP35、NS38、VP41和VP56潛在的糖基化位點為分別有15、21、37、11、6、7、36、6、6、14、4個氨基酸位點(圖2)。VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP35、NS38、VP56、NS79和VP41分別含有39、49、40、10、30、16、21、16、13、37和23個金屬結合位點(圖1)，其中VP1、VP2、VP3、VP6、VP35和NS38還分別含有2個二硫鍵結合位點(圖2)。

2.6GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6相互作用位點分析因為在PDB數據庫中只登錄有GCRV 873 VP1、VP3、VP5和VP6的PDB文件，因此只對此4個蛋白進行了蛋白互作位點分析。VP1、VP3、VP5和VP6的蛋白互作位點分別有243、273、136和114個氨基酸位點(圖2)。

2.7不同基因型代表株VP1、VP3、VP5和VP6蛋白的保守位點分析基因型Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型基因型代表株GCRV 873、GCRV HZ08和GCRV 104分離株蛋白的保守位點如下：VP1、VP3、VP5和VP6間的保守位點分別有227、269、77和18個氨基酸位點(圖2)。

2.8GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結構預測應用DeepView預測GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結構如圖3所示。

圖3　GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的三級結構Fig.3　Tertiary structures of the proteins VP1，VP3，VP5 and VP6 in GCRV 873

3討論與結論

對草魚出血病分子流行病學進行調查及對GCRV多樣性進行分析，有助于草魚出血病的防治及GCRV致病機理的闡釋。該試驗結果表明在不同基因型分離株間片段1、2、3、5、6、9編碼的結構蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP5和VP6比較保守，但有些編碼蛋白的基因所在片段不同。GCRV 873和AGCRV片段8編碼VP6蛋白，而GCRV 106、GCRV Henan988、GCRV Hunan794、GCRV JX02、GCRV HZ08、GCRV 918、GCRV GD108、GCRV 109片段9編碼VP6蛋白。非結構蛋白與結構蛋白相比變異較大，但同一基因型分離株間蛋白的同源性很高[13]。此外，即使上述蛋白同源性高達93%以上，不同分離株同源蛋白卻給予不同的名稱，如NS1與NS79、VP7與VP41、NS2與NS38、VP38、NS3與VP35等，這給GCRV多樣性分析帶來了一定的困難，由此建議同源性高的蛋白采用相同的名稱給予命名。

在基因型Ⅲ型分離株間，蛋白間的變異位點分析表明，VP1蛋白39個變異位點中有9個氨基酸位點預測為蛋白互作位點，即73、130、378、379、445、654、905、1 088和1 120 aa。VP1的糖基化位點未發生變異，在金屬結合位點中只有378 aa發生變異。在預測的VP1蛋白互作基序中，25、290、1 153、1 165和1 212 aa發生變異。VP2的50個變異位點中，2、279、315、564、765、946、1 062和1 250 aa位于VP2的互作基序，177和1 028 aa為糖基化位點，563 aa為金屬結合位點。VP3的55個變異位點中，142、147、291、295和299 aa位于互作基序，57和103 aa為潛在的糖基化位點，4和884 aa為金屬結合位點，還有17個位點為互作位點。NS1/NS79的21個變異位點中，401 aa位于互作基序，418 aa為潛在的糖基化位點。NS38/VP38的糖基化位點、金屬結合位點、互作基序和蛋白互作位點未發生變異。VP4的22個變異位點中，70和418 aa位于互作基序，349 aa為金屬結合位點。NS4/VP35的44個變異位點中，152、275、287、290和291 aa位于互作基序。VP5的31個變異位點中，554、699和715 aa位于互作基序，608 aa為糖基化位點，512 aa為金屬結合位點，且41、238、421、554和618 aa為蛋白互作位點。VP6的28個變異位點中，111和302 aa位于互作基序，101和318 aa為潛在的糖基化位點，48、75、116和178 aa為金屬結合位點，116 aa為二硫鍵結合位點。VP7/VP41的20個變異位點中，9、336和337 aa位于互作基序，69 aa為糖基化位點，155和

199 aa為金屬結合位點。VP35/VP11/NS3/NS26的11個變異位點中，195 aa位于互作基序，167 aa為金屬結合位點。由此可見，同一基因型分離株蛋白間的變異位點較少，且功能位點發生變異的更少。

Ⅰ型基因型GCRV 873、Ⅲ型基因型GCRV HZ08和Ⅳ型基因型GCRV 104比較保守的相應蛋白保守位點分析表明(以GCRV 873蛋白序列為模式序列進行相應氨基酸位點分析)，VP1的227個保守位點中70、531、574、581和831氨基酸位點為潛在的糖基化位點，197、229、238和525氨基酸位點為金屬結合位點，還有29個氨基酸位點同為預測的蛋白互作位點。VP3的269個保守位點中有29個氨基酸位點位于蛋白互作基序，609氨基酸位點為糖基化位點，119、122、135、140、410、617、836和874氨基酸位點為金屬結合位點，119和122氨基酸位點同為二硫鍵結合位點，此外還有31個位點為蛋白互作位點。VP577個保守位點中有8個氨基酸位點位于互作基序，522氨基酸位點為金屬結合位點，還有13個位點為蛋白互作位點。VP6的18個保守位點中，280氨基酸位點位于互作基序，111、165、169和179氨基酸位點為蛋白互作位點。由此可見，不同基因型分離株蛋白間的保守位點較少，且其中少數保守位點為功能位點，多數功能位點發生了變異。

結構蛋白是病毒顆粒的組成部分，非結構蛋白雖然不是病毒顆粒的組成部分，但在病毒感染和復制等過程中對病毒增殖起著極其重要的作用。目前的研究已表明病毒非結構蛋白參與調控病毒增殖、復制、感染致病等生命過程[14-15]。例如，禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)的非結構蛋白δNS在ARV復制的起始階段起著重要作用，非結構蛋白μNS在病毒裝配中起著關鍵作用，且δNS還可提高或補充μNS的活性[13，16]。

不僅草魚呼腸孤病毒不同基因型分離株結構蛋白間存在著比較大的差異，而且非結構蛋白間的變異更加顯著，據此推測草魚出血病不同癥狀可能與其病原分屬不同基因型有關。GCRV病毒蛋白及宿主蛋白參與病毒復制的作用機制及GCRV致病機制仍未闡釋清楚，草魚出血病的癥狀到底與GCRV的基因型間的關系仍有待深入調查和研究。

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Molecular Epidemiology of Hemorrhage Disease of Grass Carp and the Diversity Research of GCRV

HUANG Yi-chang1, LEI Yan2, YANG Yu-tao1, YAN Xiu-ying1*et al

(1. Guangdong Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, and Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institues, Fisheries College of Guangdong Ocean University, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088; 2. Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co. Ltd, Guangzhou, Guangdong 510515)

Abstract[Objective] The aim was to analyze the correlation between different genotypes GCRV isolates and symptoms of grass carp with hemorrhage disease. [Method] Using RT-PCR detection, the bioinformatics method was adopted to analyze differences of isolates within and between various genotypes. [Result] The molecular epidemiology of hemorrhage disease of grass carp in recent three years was analyzed. It was found that the symptom of grass carp with hemorrhage disease was “the enteritis type”, with the GCRV mostly attributed to genotype Ⅲ. It was indicated that the homologous rates of homologous proteins in diferrent isolates were more than 93%, but those proteins were named with the completely different names. It (highly homologous proteins with different names) brought some difficulties to the research of GCRV diversity. Variable sites were few among homologous proteins in different isolates attributed to the same genotype, and variable function sites were fewer in these variable sites. Conserved sites among homologous proteins in different isolates attributed to different genotypes were few, and the fewer sites among them were functional sites. There were great differences among homologously structural proteins in different isolates attributed to different genotype, and the variation of homologous non-structural proteins was more significant. [Conclusion] It is suggested that different clinical symptoms of hemorrhage disease of grass carp could be related to different pathogen genotypes.

Key wordsGrass carp reovirus (GCRV); Hemorrhage disease of grass carp; Molecular epidemiology; Diversity

基金項目國家重點基礎研究發展計劃項目(2009CB118704)。

作者簡介黃毅昌(1993- )，男，廣東佛山人，本科生，專業：水產養殖學。* 通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事水產動物病害防控。

收稿日期2016-03-12

中圖分類號S 941

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-120-06