姜黃提取物對水產動物病原菌的抑制作用

喻鵬飛，趙麗娟，董玲燕，方 明，宋玉勝，王進波*

(1.浙江大學寧波理工學院，浙江寧波 315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波315806；3.寧波聚卿舫食品有限公司，浙江寧波315032)

姜黃提取物對水產動物病原菌的抑制作用

喻鵬飛1，趙麗娟2，董玲燕2，方 明2，宋玉勝3，王進波1*

(1.浙江大學寧波理工學院，浙江寧波 315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波315806；3.寧波聚卿舫食品有限公司，浙江寧波315032)

摘要[目的]研究姜黃提取物對不同水產動物病原菌的抑制作用。[方法]采用水蒸汽蒸餾法和索氏提取法提取姜黃揮發油，采用80%乙醇浸提法制備姜黃素。利用濾紙片固相擴散法研究3種姜黃提取物對4種水產動物病原菌的抑菌活性；利用平板涂布法研究姜黃提取物對4種病原菌的的最低抑菌濃度(MIC)。[結果]2種姜黃揮發油對4種水產動物病原菌具有抑菌活性，姜黃素對銅綠假單胞菌沒有抑菌效果。姜黃揮發油的抑菌效果好于姜黃素，其中水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油抑菌效果最佳。3種提取物對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為：水蒸汽蒸餾姜黃揮發油6.25、12.5、6.25、100.0 mg/mL；索氏提取姜黃揮發油25.0、12.5、25.0、100.0mg/mL；姜黃素25.0、50.0、50.0、200.0 mg/mL。[結論]姜黃提取物對水產動物主要病原菌具有抑制作用。

關鍵詞姜黃；揮發油；姜黃素；病原菌；抑制作用

姜黃是姜科多年生草本植物姜黃的根莖，在中國、印度等國的傳統醫藥中應用廣泛，具有破血、行氣、通經、止痛的功效，能夠用于治療心腹痞滿脹痛、臂痛、癥瘕、婦女血瘀經閉、產后瘀停腹痛、跌撲損傷和癰腫等諸多疾病。大量研究發現，姜黃中的主要有效成分姜黃素具有抗癌、保肝利膽、降血脂、抗菌消炎、防治神經系統疾病等功效[1-2]。姜黃已成為國際醫藥領域研究的熱點[3-4]，目前世界各國正在開展的有關姜黃素類藥物的臨床試驗有100多項。近年來，針對姜黃素在水產動物養殖中的應用也有一些研究[5-8]，但對姜黃揮發油的在水產養殖上的應用研究尚未見報道；同時，姜黃提取物對水產病原菌的抑制效果也缺乏詳細的研究。該研究運用水蒸汽蒸餾法、索氏提取法制備姜黃揮發油，并探討了不同方法制備的姜黃揮發油和姜黃素對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌等4種水產動物病原菌的抑菌效果，測定了最低抑菌濃度(MIC)，旨在為姜黃提取物在水產養殖業中的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由浙江大學寧波理工學院微生物學實驗室保存。

1.1.2培養基。LB培養基(蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L)；固體LB培養基中另加15 g/L瓊脂粉。上述培養基按常規方法，高壓滅菌后，置 4 ℃冰箱保存，備用。

1.2方法

1.2.1水蒸汽蒸餾法提取姜黃揮發油。取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，置于1 000 mL 平底燒瓶中，加入適量的蒸餾水使其潤濕，水蒸汽蒸餾4 h，收集水-姜黃揮發油餾出液，將餾出液轉移至分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)分次萃取，萃取液加入適量的無水硫酸鈉低溫干燥24 h 后過濾，濾液旋轉蒸發揮去石油醚，，收集揮發油并稱重。

1.2.2索氏提取法提取姜黃揮發油。取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，用濾紙包成小包放入索氏提取器中，提取瓶內加入石油醚200 mL，然后固定在鐵架臺上，置于55～60 ℃恒溫水浴鍋中，同時冷凝水回流至提取器中液體無色，取出提取液，加無水硫酸鈉低溫干燥24 h 過濾，旋轉蒸發揮去濾液中的石油醚，收集揮發油并稱重。

1.2.3姜黃素的提取。取粉碎至40目的姜黃粉與80%乙醇以質量體積比1∶5～1∶10混合均勻，200 r/min，提取2 h，過濾并收集濾液，重復提取3次，將3次提取的濾液合并。濃縮至飽和，置于4 ℃結晶，得純度≥95%的精制姜黃素。

1.2.4菌體懸液及平板的制備。將供試菌分別從4 ℃冰箱中取出，接種到新鮮斜面培養基上活化后，用無菌接種環從斜面培養基上分別挑取各供試菌，將細菌接種在LB 液體培養基中，37 ℃、220 r/min震蕩培養24 h。通過平板計數法，確定菌液的稀釋度，使最后的菌懸液含量為107cfu/mL，待用。

1.2.5不同姜黃提取物的抑菌效果。用無菌移液槍吸取200 μL菌懸液于培養基的表面，用無菌涂布棒均勻涂布。用無菌鑷子夾取滅菌圓形濾紙片(直徑6 mm)，浸于50.0 mg/mL的姜黃素、姜黃揮發油(索氏提取)、姜黃揮發油(水蒸汽蒸餾)中，20 min后取出瀝干，將上述濾紙片輕輕貼在固體平板上，每個培養皿貼3片，每組做3個平行。姜黃揮發油以1%的吐溫80水溶液作為對照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水作為對照，同時設置無菌濾紙片的培養皿作為空白對照，放入恒溫培養箱中，細菌在37 ℃下培養24 h，用游標卡尺進行測量，并計算抑菌圈直徑大小的平均值。抑菌圈直徑大小(含濾紙片直徑)在7～9 mm時，為低度敏感抑菌作用；在10～15 mm時，為中度敏感抑菌作用；抑菌圈直徑>15 mm時，為高度敏感抑菌作用；無抑菌圈或抑菌圈直徑<5 mm，為沒有敏感抑菌作用。

1.2.6姜黃提取物MIC的測定。用吐溫80水溶液(1%)稀釋成不同濃度(100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.560、0.780 mg/mL)的姜黃揮發油稀釋液；姜黃素以適量二甲亞砜溶解后，用蒸餾水配制成不同濃度(200.000、150.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/mL)的姜黃素溶液。菌懸液與各濃度揮發油的稀釋液(或姜黃素溶液)1∶1混合均勻成為混合液。取0.2 mL混合液于平板中，涂布均勻，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察菌體生長情況，生長菌體為陽性(+)，不生長菌體為陰性(-)，以不生長菌體的最低濃度為該成分的最低抑菌濃度(MIC)。姜黃揮發油以1 %的吐溫80水溶液作為對照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水作為對照，每個處理重復3次。

2結果與分析

2.1不同姜黃提取物的抑菌效果該研究利用濾紙片法，分析了50 mg/mL不同姜黃提取物對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌等水產動物致病菌的抑菌效果。從表1可以看出，姜黃揮發油對水產動物病原菌的抑菌效果明顯好于姜黃素，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油對4種病原菌抑菌活性明顯高于索氏提取的姜黃揮發油。嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌等3種病原菌對2種姜黃揮發油高度敏感，對姜黃素低度敏感；銅綠假單胞菌對水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油中度敏感，對索氏提取的姜黃揮發油低度敏感，姜黃素則對銅綠假單胞菌沒有抑制作用。

表1　不同姜黃提取物的抑菌效果

注：同列數據后不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference among groups(P<0.05).

2.2水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發油對各種供試菌的MIC由表2可見，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油對水產動物病原菌的MIC各不相同。嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為6.25、12.50、6.25和100.00 mg/mL。

表2水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油對供試菌的MIC

Table 2TheMICof volatile oil extracted by water steam distillation to tested bacteria

濃度Concentrationmg/mL嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophilia鰻弧菌Vibrioanguillarum遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa100.000----50.000---+25.000---++12.500---+++6.250-+-+++3.125+++++++1.560++++++++++0.780++++++++++++對照CK++++++++++++MIC∥mg/mL6.2512.506.25100.00

注：“+”代表平板上有菌落生長，“+”越多代表菌落數越多。“-”代表平板上無菌落生長。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

2.3索氏提取的姜黃揮發油對各種供試菌的MIC從表3可以看出，索氏提取的姜黃揮發油對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為25.0、12.5、25.0和100.0 mg/mL。由表2～3可知，索氏提取的姜黃揮發油對水產病原菌的MIC較水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油高，說明水蒸汽蒸餾法獲得的姜黃揮發油具有更高的抑菌效率。

2.4姜黃素對各種供試菌的MIC由表4可見，姜黃素對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為25.0、50.0、50.0和200.0 mg/mL。從表2～4的數據可以看出，姜黃素對水產病原菌的MIC明顯高于2種姜黃揮發油，表明姜黃素對水產動物病原菌的抑菌能力低于姜黃揮發油。

3結論與討論

該研究探討了不同姜黃提取物對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌和銅綠假單胞菌等水產動物病原菌的抑制作用，測定了姜黃提取物對水產動物病原菌的最低抑菌濃度，結果發現，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油抑菌能力最強，索氏提取法提取的姜黃揮發油的抑菌能力次之，姜黃素的抑菌能力最弱。

表3索氏提取的姜黃揮發油對供試菌的MIC

Table 3TheMICof volatile oil extracted by Soxhlet method to tested bacteria

濃度Concentrationmg/mL嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophilia鰻弧菌Vibrioanguillarum遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa100.000----50.000---+25.000---++12.500+-++++6.250++++++++3.125+++++++++++1.560++++++++++++0.780++++++++++++對照CK++++++++++++MIC∥mg/mL25.012.525.0100.0

注：“+”代表平板上有菌落生長，“+”越多代表菌落數越多。“-”代表平板上無菌落生長。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

表4　姜黃素對供試菌的MIC

注：“+”代表平板上有菌落生長，“+”趙多代表菌落數越多。“-”代表平板上無菌落生長。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

不同學者對姜黃提取物的抗菌活性進行了探索，結果表明，姜黃素及姜黃揮發油均具有較強的抑菌作用[1，4]。Wang等[9]研究發現，姜黃素能夠顯著抑制蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌的生長、增殖。Chen等[10]分析指出，姜黃素具有明顯的抗真菌活性，能夠抑制假絲酵母、隱球酵母、曲霉菌、絲孢酵母、副球孢子菌等真菌的增殖。Temba等[11]研究發現，姜黃素能夠顯著降低黃曲霉孢子的數量，抑制黃曲霉造成的食物污染。Kamazeri等[12]利用水蒸汽蒸餾法提取姜黃揮發油并分析其抑菌作用，結果發現，姜黃揮發油能夠抑制枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、新型隱球酵母等菌的生長增殖。Gupta等[13]研究也證明，索氏提取的姜黃揮發油能夠抑制金黃色葡萄球菌的增殖。該研究分析了姜黃提取物對水產動物致病菌的抑制作用，結果與上述研究結論一致，姜黃揮發油和姜黃素均具有較好的抗菌效果。

從不同姜黃提取物的抑菌效果來看，水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發油>索氏提取的姜黃揮發油>姜黃素。這可能是由于水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發油中姜黃烯、龍腦(2-莰醇)、姜黃酮等成分含量較高[14]，這些成分具有較強的殺菌作用，索氏提取的姜黃揮發油中上述成分含量明顯較低，導致其抗菌活性較弱；而姜黃素為一種二酮類化合物，其抗菌效率遠不及多種混合成分構成的姜黃揮發油高。

綜上所述，姜黃提取物能夠明顯抑制水產動物病原菌的生長、增殖，具有顯著的抗菌活性，在水產養殖生產中具有廣闊的應用前景。作為姜黃素生產副產物，姜黃揮發油具有更為顯著的抗菌效果，這對姜黃的綜合開發利用具有十分重要的意義。

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Antimicrobial Activities of the Extracts fromCurcumalongaon Pathogenic Bacteria in Aquatic Animals

YU Peng-fei1, ZHAO Li-juan2, DONG Ling-yan2, WANG Jin-bo1*et al

(1.Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo, Zhejiang 315100; 2. Ningbo Traditional Chinese Pharmaceutical Co. Ltd., Ningbo, Zhejiang 315806)

Abstract[Objective] The aim was to study antimicrobial effect of the extracts from Curcuma longa on pathogenic bacteria in aquatic animals. [Method] The volatile oil was extracted from Curcuma longa by water steam distillation and Soxhlet method. Curcumin was extracted with 80% ethanol. The antimicrobial activities of the extracts were determined by plate diffuse to 4 pathogenic bacteria. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the extracts were investigated by plate spread. [Result] The results indicated that 2 kinds of volatile oils showed antibacterial activity to 4 pathogenic bacteria, curcumin had no antimicrobial effect on Pseudomonas aeruginosa. Compared to the antimicrobial activity of curcumin, the volatile oils showed stronger antimicrobial activity. The MIC to Aeromonas hydrophilia, Vibrio anguillarum, Edwardsiella tarda and Pseudomonas aeruginosa was as followed. The volatile oil extracted by water steam distil lation was 6.25, 12.5, 6.25 and 100.0 mg/mL; the volatile oil extracted by Soxhlet method was 25.0, 12.5 25.0 and 100.0 mg/mL; curcumin was 25.0, 50.0, 50.0 and 200.0 mg/mL.[Conclusion] Curcuma longa extract has inhibitory effect on the main pathogenic bacteria of aquatic livestock.

Key wordsCurcuma longa; Volatile oil; Curcumin; Pathogenic bacteria; Inhibitory effect

基金項目寧波市重大科技攻關項目(2014B11005，2013C11031，2014C 92001，2014C92017)。

作者簡介喻鵬飛(1995- )，男，河南信陽人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事天然產物藥理作用研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號S 567.23+9

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-148-03