亳芍產芍藥苷內生真菌的篩選

程孝中， 許 勇， 葛永斌， 魏 磊， 燕傲蕾， 張 宇， 劉西嶺， 徐 娟， 郭 慧

(1．亳州學院，安徽亳州 236800；2.安徽省醫學科學研究院,安徽合肥 230061)

亳芍產芍藥苷內生真菌的篩選

程孝中1， 許 勇2*， 葛永斌1， 魏 磊1， 燕傲蕾1， 張 宇1， 劉西嶺1， 徐 娟1， 郭 慧1

(1．亳州學院，安徽亳州 236800；2.安徽省醫學科學研究院,安徽合肥 230061)

摘要[目的]篩選亳芍產芍藥苷內生真菌。[方法]采用組織塊法從亳芍的根部分離內生真菌；從內生真菌發酵液中抽提芍藥苷；然后通過薄層層析、高效液相色譜分析和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對內生真菌所產芍藥苷進行鑒定。[結果]從亳芍中分離到22株內生真菌，其中1株為產芍藥苷內生真菌，經形態學初步鑒定為細腳棒束孢種(Isaria tenuipes)。[結論]從亳芍中分離到了一株產芍藥苷內生真菌R12，可作為芍藥苷藥物工業化生產的候選菌株。

關鍵詞亳芍；內生真菌；芍藥苷;篩選

植物內生真菌(Endophytic fungi)是指在某一時期生活在植物體內，但對寄主植物組織并不引起明顯病害癥狀的真菌[1]，“內共生理論”認為內生真菌可產生與其宿主相同或相似的代謝物質，1993年美國蒙大拿州立大學Strobel首次從短葉紅豆杉的韌皮部分離到一株具有合成與宿主相同抗癌藥物——紫杉醇的內生真菌[2]。隨后，許多科研工作者相繼從不同植物體內分離得到產生抗癌活性物質、抗菌活性物質等其他藥用物質的內生真菌[3-5]。

芍藥苷(paeoniflorin)為芍藥的主要活性成分，能夠抑制腎臟中的ICAM-1、IL-1、TNF-α等細胞因子，起到抗炎癥、抗氧化作用[6]。芍藥苷通過調節腺苷A1受體減少痛疼，抑制前列腺素E2、白三烯B4來減少炎癥反應，促進淋巴細胞增殖和分化來實施免疫保護[7]；在抑制血管發生[8]、抗過敏[9]等方面均發揮了重要的作用。但芍藥生長周期較長(3～4 a)[10]，原產地種植率下降，地道的亳芍產量急劇下降，加上芍藥苷化學合成較難，芍藥苷的市場來源越來越困難，因此通過微生物發酵方法生產芍藥苷具有重要意義。筆者采用組織塊法從亳芍的根部分離內生真菌，從內生真菌發酵液中抽提芍藥苷，然后通過薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)分析和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)對內生真菌所產芍藥苷進行鑒定，篩選能夠產芍藥苷的內生真菌，為微生物發酵生產芍藥苷提供候選菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。亳芍采自亳州學院中藥園(3年生)，取植株的根部位。

1.1.2儀器與試劑。SD25-12DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；DIIG-9141A電熱鼓風干燥箱(上海精宏試驗設備有限公司)；GI54DWS 高壓蒸汽滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；SW-CJ-2FD凈化工作臺(AIRTECH)；ZXSD-A1160培養箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；E2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(New ultrafleXtreme MALDI TOF，Bruker Daltonics)。芍藥苷標準品為阿拉丁產品；2,5-二羥基苯甲酸(DHB)為Sigma-Aldrich產品，其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1內生真菌的分離與純化。取亳芍根部位，洗潔精漂洗1遍，流動水洗至無泡沫。在超凈工作臺上，用75%酒精消毒1 min，無菌水洗滌3遍，0.1%升汞消毒6 min，再用無菌水洗滌3遍，無菌濾紙吸干殘留水分，剪切成0.5 cm×0.5 cm小片接種于馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)平皿上，置于28 ℃培養箱培養3～6 d，即可見小片切割邊緣長出菌絲，挑取菌絲接種于另一PDA斜面上備用。對照組使用未切割的小片，其余操作同試驗組，證明所分離的菌是來源于植物體內而非表面附生菌。

1.2.2產芍藥苷菌株的篩選。液體培養基采用PDA液體培養基，挑取備用的菌絲接種于100 mL PDA液體培養基中，接種5瓶，28 ℃搖床，120 r/min培養7 d。收集發酵液，經過濾、凍融后，加入等體積氯仿萃取，有機相濃縮得到內生真菌的粗提物。

1.2.3薄層層析(TLC)檢測[10]。展開劑為氯仿∶甲醇(3∶1)，顯色劑為5%香草醛硫酸乙醇溶液，顯色后記錄芍藥苷標準品和樣品的Rf值。

1.2.4高效液相色譜分析(HPLC)。色譜柱C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和含0.1%三氟乙酸的水(14∶86)；流速1 mL/min；檢測波長230 nm。以芍藥苷標準品為參考。

1.2.5基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI -TOF)分析。取樣品1 μL點靶，等樣品風干后，再取基質DHB 1 μL點在樣品上面，自然風干形成結晶后進行打靶。

1.2.6菌株的初步鑒定。形態學分類依據內生真菌的菌落外部形態進行分類[11]。

2結果與分析

2.1內生真菌活性產物芍藥苷的鑒定

2.1.1TLC檢測。利用TLC法對22株內生真菌發酵液提取物進行鑒定發現，菌株R12粗提物中出現一個斑點與芍藥苷標準品的遷移率最接近，標準品和R12粗提物的Rf值分別為0.54、0.51(圖1)，混合點顯示樣品點與標準品點重合完好。

2.1.2 HPLC分析。對菌株R12粗提物進行HPLC分析，R12菌株提取物中最高峰出峰時間為7.773 min，芍藥苷標準品出峰時間為7.801 min(圖2)，二者出峰時間非常接近，表明R12粗提物中含有芍藥苷，菌株R12為產芍藥苷內生真菌。根據峰面積計算出R12菌株菌液中芍藥苷濃度為0.44 mg/L。

注：1為標準品；2為R12粗提物；3為混合點。Note: 1. Paeoniflorin standard;2. Extracts from strain R12;3. Mixture of paeoniflorin standard and extracts from strain R12.圖1　內生真菌R12菌株產芍藥苷的TLC分析Fig. 1　The TLC analysis of endophytic fungi R12 producing paeoniflorin

圖2　芍藥苷標準品(a)和R12提取物(b)的HPLC分析Fig.2　HPLC analysis of standard paeoniflorin(a) and fungal paeoniflorin from R12(b)

2.1.3MALDI -TOF分析。為了進一步確定HPLC中7.773 min出峰的物質，收集7.773 min的物質進行質譜分析，結果發現，芍藥苷分子量為480.46，質譜圖中出現2個離子峰(圖3)，分別為503.157(M+Na+)和519.127(M+K+)，進一步證明菌株R12的代謝產物中含芍藥苷，菌株R12為產芍藥苷內生真菌。

圖3　R12提取物的MALDI-TOF分析Fig. 3　MALDI-TOF of fungal paeoniflorin from strain R12

圖4　產芍藥苷內生真菌R12的菌落形態Fig. 4　The colony morphology of paeoniflorin-producing endophytic fungi strain R12

2.2種屬初步鑒定產芍藥苷內生真菌R12在PDA培養基上培養7 d，菌落直徑為3 cm左右，絨毛狀，白色，菌落疏松，不規則形，背面呈暗棕色，不易挑取，延長培養產生孢梗束，液體培養5 d后，菌絲球達3～5 mm，菌液黃色(圖4)。與《中國真菌志》(第四十三卷)[11]棒束孢屬(Isaria)細腳棒束孢種(Isaria tenuipes)菌落形態描述極為相似。

3結論與討論

在分離內生真菌過程中，利用未切割的亳芍根部組織做同樣的培養，發現并沒有真菌生長，證明試驗組分離到的22株真菌均為內生真菌。內生真菌分布比較廣泛，植物不同部位均有分布，且次生代謝產物十分豐富[12],由于亳芍以根部入藥，故該試驗中是從亳芍根部分離內生真菌，分離到的內生真菌只是亳芍內生真菌的一部分，接下來的試驗可以從亳芍葉、莖等部位分離更多的內生真菌，可能會篩選到產量更高的產芍藥苷內生真菌。

R12菌株是首次從亳芍根部分離到的能夠產芍藥苷的內生真菌，在鑒定R12提取物時，除了傳統方法TLC和HPLC分析外，該試驗采用了MALDI-TOF對提取物進行分子量驗證，MALDI-TOF是近年來發展起來的一種新型軟電離質譜技術,其檢測和鑒定具有快速、準確、靈敏等優點，對樣品的量要求較少[13]，試驗數據進一步證明了R12菌株是產芍藥苷內生真菌。

在鑒定R12菌株方面，根據形態學初步鑒定為棒束孢屬(Isaria)細腳棒束孢種(Isaria tenuipes)。進一步鑒定和確認R12菌株方面，還需要利用分子生物學擴增保守序列并結合生物信息學，構建生物分類系統進化樹。

該試驗中產芍藥苷菌株R12初步發酵產量為0.44 mg/L，未進行發酵條件優化，下一步可以進行R12發酵條件的探索，以提高芍藥苷發酵產量，為工業化提供更成熟的發酵條件。在提高發酵產量方面，還可以通過代謝工程對芍藥苷代謝途徑進行控制，但目前芍藥苷生物合成途徑研究較少，對于芍藥苷上下游產物以及關鍵合成酶研究尚不深入，基礎研究的不足限制了芍藥苷發酵產量的優化，將來這些代謝節點的研究均可為芍藥苷代謝途徑控制提供基礎。

參考文獻

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Screening of Producing Paeoniflorin Endophytic Fungi fromPaeonialactiflora

CHENG Xiao-zhong1,XU Yong2*,GE Yong-bin1et al

(1. Bozhou University,Bozhou,Anhui 236800; 2. Anhui Academy of Medical Sciences,Hefei,Anhui 230061)

Abstract[Objective] To isolate paeoniflorin-producing endophytic fungi strains from Paeonia lactiflora. [Method] The endophytic fungi were isolated from the root of Paeonia lactiflora using tissue explants;The paeoniflorin from endophytic fungi were confirmed by thin layer chromatography(TLC), high performance liquid chromatography(HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF). [Result] A total of 22 endophytic fungi were isolated from the root of Paeonia lactiflora.1 strain was recognized as an endophytic fungi capable of producing paeoniflorin and classified asIsaria tenuipes. [Conclusion]The separated endophytic fungi,strain R12,can be a candidate for paeoniflorin production.

Key wordsPaeonia lactiflora; Endophytic fungi; Paeoniflorin; Screening

基金項目安徽省高校自然科學基金項目(KJ2014A167)。

作者簡介程孝中(1983-)，男，安徽安慶人，講師，在讀博士，從事中草藥組織培養和內生菌研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事分子生物學及生物化學研究。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號Q 813.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-162-03