氨基酸前體對棘白霉素B發酵合成的影響

王耀耀，　付美紅，　朱研研，　郝惠云，　王亞莉，　張雪霞

微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，石家莊 050015

氨基酸前體對棘白霉素B發酵合成的影響

王耀耀，付美紅，朱研研，郝惠云，王亞莉，張雪霞*

微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，石家莊 050015

摘要：以構巢曲霉(Aspergillus nidulans)發酵生產酯肽類化合物棘白霉素B，研究棘白霉素B己肽環結構的前體性氨基酸對產物的代謝影響，顯示出脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸在發酵48 h補入，對發酵代謝有促進作用。利用響應面統計學方法進行前體及有機氮源配方優化，得出優化配方：脯氨酸4.55 mg/mL,鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%，搖瓶發酵水平達到3 270 μg/mL，較原水平提高30.2%。新工藝在50 L罐上放大，發酵水平進一步提高至3 520 μg/mL，顯示出良好的工業應用前景。

關鍵詞：棘白霉素B； 酯肽； 響應面統計學方法； 氨基酸前體

阿尼芬凈是繼卡波芬凈、米卡芬凈之后開發出的又一個重要的芬凈類抗生素藥物。其合成途徑包括利用曲霉發酵獲取先導性化合物——棘白霉素B(ECB)，再經脫?；コ舅醾孺湥詈筮M行側鏈化學結構改造而成藥[1]。芬凈類對近年來日益嚴重的侵襲性念珠菌感染有顯著療效[2,3]。藥物作用機理為通過非特異性抑制真菌細胞壁的β-(1, 3)-D-葡聚糖合成酶，導致葡聚糖合成受阻，破壞真菌細胞壁完整性，最終導致真菌細胞溶解死亡[4]。阿尼芬凈抗菌譜廣，對多數念珠類如白色念珠菌、熱帶念珠菌以及煙曲菌和新型隱球菌等菌屬均有抑菌或殺菌作用，特別對于唑類和兩性霉素B耐藥菌有顯著抗菌活性，沒有藥物交叉反應。其藥物安全性高，顯著優于傳統抗真菌藥物兩性霉素B[5,6]。

棘白霉素B是最早被發現的棘白霉素家族中第一個天然化合物[7]，由曲霉菌發酵產生。棘白霉素B具有典型的棘白類家族的特殊己肽環結構，肽環的主要氨基酸組成為脯氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸，生物合成遵循非核糖體多肽合成途徑(NRPS)[8]。作為新一代抗真菌藥物，芬凈類抗生素得到研究工作者們的廣泛關注。研究范疇涉及化合物的化學多樣性結構改造[9]、菌種選育[10]、生物合成[11]等眾多領域。有關使用構巢曲霉進行ECB的發酵研究，鄒樹平等人[12]對菌種進行傳統遺傳育種改造，并針對發酵配方中的碳、氮、磷源進行配方優化；Hodges等人[13,14]對構巢曲霉發酵代謝副產物柄曲霉素進行基因敲除，從分子水平上對合成途徑進行了揭示和討論；Cockshott等人[15,16]報道了ECB發酵培養基優化后的最適工藝條件。針對ECB合成己肽環相關氨基酸對發酵代謝的研究尚無報道。

本文根據ECB生物合成途徑, 研究了不同氨基酸前體結合有機氮源對構巢曲霉生長、代謝以及產物合成的影響。利用響應面方法的統計學研究特點[17]，圍繞中心點進行合理的分組設計，采用多元二次方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過方差分析確定擬合曲線的顯著性，在三維空間層面上分析氨基酸與天然有機氮源以及前體因素之間的交互影響，尋求響應值最高點。前體工藝優化使ECB發酵水平得到有效提升，為ECB的工業化放大生產提供了理論和數據基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種

棘白霉素B產生菌(Aspergillusnidulans)NCPC1246由本研究室保藏。

1.1.2主要試劑和培養基

棘白霉素B的對照品(按文獻方法制備并標定[18]，純度98%)；糊精(北京雙旋雙旋微生物培養基制品廠)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(北京雙旋微生物培養基制品廠)；硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉等無機鹽為化學純試劑(天津瑞金特化學品有限公司)；棉籽餅粉(中棉紫光生物科技有限公司)；氨基酸(北京欣經科生物技術公司)，甲醇(分析純)。

斜面培養基(g/L):馬鈴薯葡萄糖瓊脂62.5，瓊脂5。母瓶培養基(g/L)：葡萄糖20，硫酸銨10，棉籽餅粉15，磷酸二氫鉀5，氯化鈉5，七水硫酸鎂2，七水硫酸亞鐵1，消前pH 6.5。發酵培養基(g/L)：糊精35.0，葡萄糖12.0，硫酸銨20.0，棉籽餅粉30.0，磷酸二氫鉀8.0，氯化鈉5.0，七水硫酸鎂2.0，七水硫酸亞鐵1.0，碳酸鈣2.0，消前pH 6.2。培養基均在121 ℃下滅菌30 min。

1.1.3儀器

調速搖瓶機INNOVO5000；島津液相色譜儀LC-2010AHT；珠江牌生化培養箱(廣東醫療器械廠)LRH-150II；超低溫冰箱Thermo ULT1786；離心機(上海安亭科學儀器廠)LXJ-IIB；光學顯微鏡Olympus CX41。

1.2方法

1.2.1培養條件

斜面培養條件：25 ℃, 相對濕度30%～60%, 培養7 d～8 d。

搖瓶培養條件：培養成熟的斜面挖塊接種于裝40 mL種子培養基的母瓶中，25 ℃、220 r/min培養48 h，然后以3%接種量接入裝40 mL發酵液的發酵瓶中，25 ℃、220 r/min發酵6 d。

50 L罐培養條件：采用二級發酵方式，斜面接種于裝有200 mL種子培養基的1 L三角瓶中，25 ℃、220 r/min培養48 h后，以0.5%接種量接入種子罐，25 ℃培養，周期40 h～48 h，發酵接種量3%，發酵罐接種后發酵液體積為30 L，培養周期120 h～144 h，轉速300 r/min～400 r/min。

1.2.2發酵液效價檢測

取發酵液1 mL，用10倍95%乙醇浸提，超聲0.5 h，3 000 r/min離心15 min，上清液經膜過濾進行HPLC分析。HPLC色譜分析條件參考文獻[18]。

1.2.3前體考察試驗

(1) 前體氨基酸單因素考察試驗

以原發酵培養基為對照，分別在發酵培養基中添加終濃度為1 mg/mL的脯氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸，進行發酵培養，于144 h放瓶，檢測菌體量及ECB發酵水平。

(2) 前體添加時間及劑量范圍的考察

選取對發酵代謝有促進作用的氨基酸前體，分別在消前、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h添加氨基酸前體，檢測放瓶時ECB產物發酵水平。按照主要有機氮源棉籽餅粉高低兩個劑量分組，高劑量組棉籽粉3.0%，低劑量組棉籽餅粉2.0%，氨基酸劑量考察范圍為0.1 mg/mL～10 mg/mL，分組取值0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，進行搖瓶發酵培養，檢測放瓶時菌體量及ECB發酵水平。

(3) 前體氨基酸與有機氮源響應面統計方法分析

使用Design-expert7.0軟件進行Box-Behnken響應面設計，以預試驗確定的氨基酸及有機氮源取值范圍為基礎，設定因素值，每因素取三個水平，通過對試驗數據進行分析以獲取最優方案。

2結果與討論

2.1前體氨基酸單因素影響

棘白霉素B為棘白霉素家族中具有環己肽環和脂肪酸側鏈的天然酯肽類化合物，己肽環的主要氨基酸組成為4R,5R-二羥基-L-鳥氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S,4S-二羥基-L高酪氨酸、3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸、兩個L-蘇氨酸。與棘白霉素類pneumocandinA0結構相比較，其典型差異為R7位的谷氨酰胺為蘇氨酸所取代。針對pneumocandinA0進行的氨基酸研究顯示3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸的前體為亮氨酸，而非脯氨酸[19]。所以，在試驗設計中，也選取了亮氨酸進行前體作用考察。

如圖1所示，在發酵培養基中添加終濃度為1 mg/mL的脯氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸，能夠提高ECB的發酵水平。與對照相比，ECB產量分別提高5.5%、4.7%和3.2%。添加酪氨酸使菌絲量較對照增加4.3%，但對產物合成促進作用不顯著。添加亮氨酸，菌體量減少，ECB發酵水平也有所降低。

圖1　添加不同前體對ECB發酵水平的影響

2.2前體補料時間的影響及劑量范圍考察

對優選出的脯氨酸、蘇氨酸和鳥氨酸在發酵前期、中期和后期進行補料考察。如圖2所示，0 h～24 h補加三種氨基酸對發酵產量的影響不顯著，48 h～96 h相較對照組提高程度最為顯著。觀察構巢曲霉菌絲形態，前期菌絲分散，呈米白色，菌體量快速增長，初級代謝特征顯著；48 h后，菌絲結球呈顆粒狀，顏色逐漸加深，營養利用加速，培養基逐漸澄清，產物合成速度加快。在此期間，氨基酸發揮前體促進作用。最適補加時間為48 h，三種氨基酸提高比例達5.1%～8.8%。

圖2　前體氨基酸補料時間對發酵的影響

設定原發酵配方中主要有機氮源—棉籽餅粉分別為3.0%、2.2%，進行氨基酸補料濃度范圍考察。在考察劑量范圍內呈現出作用不顯著、促進、毒性三種影響趨勢(表1)。棉籽粉3.0%時，脯氨酸優勢表現集中在1.0 mg/mL～5.0 mg/mL，發酵相對效價提高8.5%～12.1%；鳥氨酸0.5 mg/mL～2.0 mg/mL時，發酵相對效價提高4.2%～7.3%；蘇氨酸0.5 mg/mL～1.0 mg/mL時，發酵相對效價提高4.9%～6.8%。在低氮條件下，雖然整體發酵水平有所下降，但是前體作用對發酵代謝的影響更加突出，脯氨酸在適宜濃度范圍發酵相對效價提高至10.6%～15.4%；鳥氨酸單因素影響發酵相對效價提高至5.7%～10.1%；蘇氨酸單因素影響發酵相對效價提高5.5%～12.4%。

表1　棉籽餅粉及氨基酸濃度對發酵產量的影響

2.3響應面統計方法優化發酵培養前體氨基酸與有機氮源配方組合

2.3.1最陡爬坡實驗

根據優選出的前體氨基酸脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸以及原配方中有機氮源棉籽粉相互影響考察結果，設定其變化方向及步長，進行最陡爬坡實驗，進一步縮小響應面目標區域。如表2所示，選取第4組為中心濃度。

2.3.2二次回歸曲線擬合及方差分析顯著性檢驗

在上述實驗基礎之上，利用軟件design-expert 7.0進行Box-behnken響應面分析，設計4因素3水平試驗，試驗設計組24組，中心濃度組重復5次(表3、表4)。

表2　最陡爬坡實驗設計及結果

表3　Box-behnken試驗設計因素水平表

表4　Box-Behnken試驗設計及結果

以ECB發酵單位為響應值，對試驗結果作二次回歸擬合，得到二次方程：

Y=-47 759.92+1 057.70X1+4 786.07X2+6 627.67X3+31 159.50X4+182.00X1X2+372.50X1X3-191.25X1X4-545.00X2X3-905.00X2X4-106.25X3X4-137.78X12-734.60X22-3 638.12X32-5 441.25X42

方差分析結果如表5所示。擬合曲線方程概率P<0.0001，為高度顯著性影響；失擬項P為0.224 5，表示擬合曲線與實驗數據不符情況為不顯著；方程中各項X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42影響顯著；R2為0.96(表6)，調整R2為0.920 1，擬合曲線相關性好；精確度16.056，變異率2.38%，顯示試驗精確度高，擬合二次曲線適用于本試驗設計的進一步引導和優化。

表5　回歸方程方差分析

表6　模型可信度分析

2.3.3響應面分析及最佳培養基成分確定

響應面分析結果如圖2所示，得最優解為：脯氨酸4.55 mg/mL，鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%，預報最大響應值為3 094.68 μg/mL。

圖3　響應面三維空間分析圖

工藝通氣量/(r/min)產量/(μg/mL)菌體量/%新工藝原工藝220315047250327052220250860250251162

2.3.4搖瓶驗證

以優化的氮源及前體補料工藝在250 mL搖瓶中進行工藝驗證，前體氨基酸組方于發酵48 h一次補入，144 h放瓶時菌體量降低至對照組的78.3%，ECB發酵水平提升至3 150 μg/mL。進一步提高搖床轉速，增加溶氧，優化工藝的搖瓶水平可繼續提升至3 270 μg/mL，較原工藝提升幅度達30.2%。

2.3.5罐放大試驗

新工藝在50 L罐上進行二級發酵放大，前期0 h～24 h通氣量1.8 m3/h，攪拌轉速300 r/min，48 h以后提高通氣量為2.2 m3/h，攪拌轉速400 r/min，于48 h進行前體組方一次性補料，發酵周期144 h。發酵前期菌體量增至32%。44 h～48 h菌絲漸成球狀顆粒，次級代謝啟動，效價單位快速增長，期間碳氮代謝平衡，pH維持在6.2～6.5，溶氧水平達到50%以上，顯著優于原工藝。至放罐時，菌絲量達到40.3%，放罐單位達到3 520 μg/mL，較原工藝水平提高39.5%。

原工藝

前體補料工藝

3結論

根據棘白霉素B生物合成途徑，考察參與己肽環合成的5種氨基酸對構巢曲霉的發酵代謝影響，確定了三種在發酵中表現為促進作用的前體性氨基酸：脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸。結合有機氮源基礎發酵配方，表現出氨基酸前體與原配方中天然有機氮源有明顯交互影響。在高氮源環境下，容易產生前體代謝反饋抑制。采用deaign-expert7.0軟件中響應面統計學方法，針對三種氨基酸和棉籽粉進行實驗設計及統計學分析和組方優化，得到高度顯著性的擬合二次曲線，推算出最大響應值配方為：脯氨酸4.55 mg/mL，鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%。搖瓶驗證發酵水平可達3 270 μg/mL，提高幅度30.2%。50 L罐放大進一步顯示新工藝的優勢，表現為菌絲量降至對照值的78.8%，次級代謝過程中溶氧水平顯著改善，碳氮源利用平衡，放罐發酵水平達到3 520 μg/mL，較原工藝水平提高39.5%。

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Effects of amino acid precursors on echinocandin B biosynthesis

WANG Yao-yao, FU Mei-hong, ZHU Yan-yan, HAO Hui-yun, WANG Ya-li, ZHANG Xue-xia

National Engineering Research Center of Microbial Medicine;Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center;New Drug Research & Development Company of NCPC, Shijiazhuang 050015

AbstractEchinocandin B (ECB), a lipopeptide natural product, was produced by Aspergillus nidulans strain. Biosynthesis of ECB was influenced by amino acid precursors of hexapeptide. It was showed that L-proline, L-ornithine and L-threonine could improve the synthesis of secondary metabolites, and the proper precursor feeding time was 48 h. By response surface methodology, the optimized concentrations of precursors and organic nitrogen source were obtained. The proper composition contained L-proline 4.55 mg/mL, L-ornithine 1.85 mg/mL, L-threonine 0.97 mg/mL, cottonseed meal 2.62%. Under the optimal fermentation conditions, yield of ECB reached to 3 270 μg/mL in shake flask, which increased by 30.2% compared with original level. Furthermore, a fed-batch culture in a 50 L fermentor was conducted. The yield of ECB further reached to 3 520 μg/mL, which indicated great potential in industrial applications.

Key wordsechinocandin B; lipopeptide; response surface methodology; amino acid precursors

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.001

基金項目：國家“重大新藥創制”科技專項(2014ZX09201001-002)。

作者簡介：王耀耀(1971～)，女，江蘇省泰州，高級工程師，從事生物制藥研究。E-mail:wyy711024@126.com。 *通訊作者：張雪霞，女，研究員級正高級工程師，從事天然藥物研究。Tel.:0311-86685347，E-mail:zhangxuexiazxx@163.com。