海參i-型溶菌酶在畢赤酵母基因工程菌中優化表達及純化

馬　俊，　張　洋，　叢麗娜，　李　成

大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034

海參i-型溶菌酶在畢赤酵母基因工程菌中優化表達及純化

馬俊，張洋，叢麗娜*，李成

大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034

摘要：將實驗室已構建的畢赤酵母基因工程菌(pPIC9K-SjLys/GS115)作為海參i-型溶菌酶生產菌株，本研究分別從甲醇濃度、培養基pH、溫度和誘導時間對其產酶發酵條件進行優化。實驗得出甲醇誘導濃度為1.0%，發酵培養基初始pH 6.0，溫度30 ℃，培養96 h為最佳目的蛋白表達條件，其發酵液中海參i-型溶菌酶含量達10.63 mg/L。將發酵液經離心和超濾濃縮后得到上清液，再經離子交換和凝膠過濾層析純化獲得海參i-型溶菌酶產品，其酶活力達826.44 U/mg。經測定該酶對革蘭氏陽性菌溶壁微球菌和革蘭氏陰性菌副溶血弧菌均具有明顯的抑菌作用。

關鍵詞：海參i-型溶菌酶； 畢赤酵母； 發酵條件優化； 酶活性

溶菌酶廣泛分布于不同生物體中，同時作為先天免疫因子具有較廣的抗菌譜[1]。它通過破壞細菌細胞壁中肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，從而使其原有結構受到破壞造成菌體死亡[2]。溶菌酶作為一種天然的蛋白質具有對人體無毒性，易吸收，不污染等特性[3]。根據溶菌酶的來源分類可為動物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌體溶菌酶。同時動物溶菌酶包含三種類型，即c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和i-型溶菌酶。i-型溶菌酶最早由Jolles于1975年在歐洲海星中發現[4]，隨后相繼在貝類、蝦、海參、海膽等海洋生物中發現該類菌酶[5,6]。海參i-型溶菌酶基因由本實驗室于2007年首次分離和鑒定[7]；進一步研究發現，該溶菌酶具有廣譜抗菌活性，尤其對革蘭氏陰性菌，如弧菌和假單胞菌這兩種常引起水產動物嚴重病害的病原菌，具有明顯的殺傷力[8]。

巴斯德畢赤酵母表達系統是迄今為止應用最廣的外源基因表達系統之一。它不僅克服了大腸桿菌表達系統不能表達結構復雜的蛋白質、表達產物多為不溶性包涵體、表達產量低、背景蛋白多等缺點，而且具有生長快、翻譯后修飾、操作簡單等優點[9]。Wang等[10]將T4溶菌酶基因導入到甲醇型酵母中并成功表達。Zhao等[11]利用畢赤酵母表達LYZL6，并且通過條件優化確定最佳發酵條件。

本實驗室的前期研究已將海參i-型溶菌酶基因導入畢赤酵母中進行表達，然而目的蛋白表達量較低[12]。為了提高該溶菌酶的表達水平，本實驗從甲醇濃度、培養基pH、溫度和誘導時間幾個方面對搖瓶發酵條件進行優化，并對表達產物進行純化及抑菌活性的測定，為今后大規模的發酵生產海參i-型溶菌酶奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株

實驗菌株：海參i-型溶菌酶畢赤酵母基因工程菌 pPIC9K-SjLys/GS115，由本實驗室構建；指示菌菌株溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)，副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)由本實驗室保存。

1.2試劑

蛋白低分子量Marker購自TaKaRa Biotechnology(大連)公司；弱酸性陽離子交換柱CM Sepharose Fast Flow和凝膠過濾柱Sephacryl S-100 High Resolution購自GE公司，其它試劑均為國產分析純。

1.3培養基

YPD培養基：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖。

BMGY培養基：1.34%YNB，1%甘油，4×10-7生物素，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖溶液(pH 6.0)，1%酵母提取物，2%胰蛋白胨。

BMMY培養基：1.34%YNB，0.5%甲醇，4×10-7生物素，100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 6.0)，1%酵母提取物，2%胰蛋白胨。

1.4培養方法

1.4.1搖瓶培養

從YPD平板上挑取一個畢赤酵母基因工程菌單菌落，接種到25 mL BMGY培養基中。在30 ℃、230 r/min條件下培養14 h～16 h，至OD600=4～5。將收集的種子液于4 ℃、4 000 r/min離心5 min，棄盡上清，并用100 mL BMMY培養基重懸菌體。初始發酵條件為溫度28 ℃、pH 6.0、轉速250 r/min條件下培養120 h，每24 h加入1.5%甲醇誘導表達海參i-型溶菌酶。

1.4.2海參i-型溶菌酶表達條件的優化

采用單因素試驗方法。改變其中一個發酵條件，固定其他因素不變，實驗重復三次。分別選取濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%甲醇誘導表達。分別配制pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 BMMY發酵培養基。發酵溫度分別選擇26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃。發酵培養液在第0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取樣，檢測海參i-型溶菌酶表達含量及活性。

1.5海參i-型溶菌酶的純化

將誘導后的發酵液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。選用5 kD的超濾膜對上清液進行超濾濃縮，再用20 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液透析濃縮液。根據海參i-型溶菌酶的等電點選用弱酸性陽離子交換柱CM Sepharose Fast Flow進行純化。首先用磷酸鹽緩沖液平衡柱子，上樣后用0～1 mol/L NaCl進行梯度洗脫，流速為2.5 mL/min。收集具有抑菌活性的流出液，并用超濾管濃縮。根據該酶的分子量大小選用凝膠層析柱Sephacryl S-100 High Resolution進一步純化。凝膠層析柱經平衡后加入樣品，設定流速為1 mL/min，之后用20 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液洗脫柱子，利用自動分部收集器收集流出液，檢測流出液中蛋白含量及溶菌酶活性。

1.6蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法，測定發酵液總蛋白含量。將1 mL發酵液濃縮并進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳膠上樣品表達條帶經凝膠成像儀掃描后，再使用BandScan5.0軟件分析，得出海參i-型溶菌酶所占總蛋白的比例，從而計算出該酶的產量。

1.7溶菌酶活力測定

采用比濁法測定溶菌酶活性。選用200 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)溶解溶壁微球菌菌粉，使底物的吸光度達到OD450=0.45～0.77。首先將底物與樣品在25 ℃條件下分別預熱，取2 mL底物與1 mL樣品迅速混合，每隔15 s測1次OD450，共計時3 min。酶活力單位的定義：在溫度25 ℃、pH 6.2 條件下，波長在450 nm處，每分鐘引起吸光度下降0.001為1個酶活力單位(1 U)。

1.8抑菌活性測定

采用牛津杯法對海參i-型溶菌酶的抑菌活性進行檢測。選用革蘭氏陽性菌溶壁微球菌和革蘭氏陰性菌副溶血弧菌作為指示菌。在LB固體培養基上分別均勻涂布這兩種指示菌，放上已滅菌的牛津杯，并向杯中加入200 μL樣品。在37 ℃條件下，過夜培養，測定抑菌圈直徑。

2結果與討論

2.1甲醇誘導濃度對發酵產酶的影響

通過SDS-PAGE分析發酵液中目的蛋白表達水平，利用比濁法測定發酵液中海參i-型溶菌酶活性，根據最大酶活力計算出相對酶活力。不同甲醇誘導濃度對畢赤酵母基因工程菌產海參i-型溶菌酶(SjLys)的影響如圖1所示。實驗發現，發酵液在14.3 kD處有明顯的電泳條帶，表明目的蛋白成功表達。甲醇既是畢赤酵母的碳源，也是外源基因表達的誘導物[13]。添加不同濃度的甲醇對海參溶菌酶的表達有不同的影響。當甲醇濃度為1.0%時，SjLys的活性最高。甲醇濃度為2.0%時，相對酶活力為66%。這表明過高濃度的甲醇對畢赤酵母有毒害作用，抑制畢赤酵母的生長與蛋白分泌。根據以上實驗結果選擇濃度為1%甲醇為最佳誘導量。

M：Marker； 1：0.5%甲醇； 2：1.0%甲醇；3：1.5%甲醇； 4：2.0%甲醇

圖1　甲醇誘導濃度對海參i-型溶菌酶的表達電泳

2.2培養基初始pH對產酶的影響

畢赤酵母細胞生長的最適pH和海參溶菌酶活性的最適pH，這些是影響發酵培養pH選擇的兩個因素[14]。發酵培養基中的不同初始pH對海參i-型溶菌酶表達的影響如圖2所示。在pH為6.0時，SjLys的活性最高。當pH為4.0時，相對酶活力為57%，這表明較低pH使該溶菌酶表達量和活性明顯降低。而過高的pH也同樣影響畢赤酵母的生長，當pH為7.0時，相對酶活力為83%。根據以上實驗結果，將pH 6.0作為發酵培養基的最佳值。

2.3發酵溫度對發酵產酶的影響

畢赤酵母的最適生長溫度為28 ℃～30 ℃，然而根據表達不同的外源蛋白，最佳誘導溫度也不同[15]。本實驗不同的發酵溫度對海參i-型溶菌酶表達的影響如圖3所示。當培養溫度低于28 ℃，發酵液中SjLys活性較低，因為在該條件下畢赤酵母生長緩慢，分泌較少的目的蛋白。當誘導溫度為32 ℃，相對酶活力為78%，因為過高的溫度使畢赤酵母出現死亡。當誘導溫度為30 ℃時，該酶活性最高。根據以上實驗結果，選擇30 ℃為最佳培養溫度。

M：Marker；1：pH 4.0發酵培養基；2：pH 5.0發酵培養基；3：pH 6.0發酵培養基； 4：pH 7.0發酵培養基

圖2　發酵培養基初始pH對海參i-型溶菌酶的

2.4發酵時間對發酵產酶的影響

不同發酵時間對海參i-型溶菌酶表達的影響如圖4所示。隨著發酵時間的增加，SjLys產量及活性持續增加，在96 h之后呈平穩的趨勢。畢赤酵母基因工程菌隨時間逐漸衰老，產酶的能力下降，并且大量產物的積累對菌株的生長產生了抑制。根據以上實驗結果，選擇96 h為最佳發酵時間。

根據以上的發酵條件優化，確定搖瓶中生產海參i-型溶菌酶的最佳發酵條件為發酵液初始pH 6.0，培養溫度30 ℃，每24 h向培養液中添加1%甲醇，培養時間96 h，海參i-型溶菌酶產量達10.63 mg/L。

M：Marker； 1：發酵溫度26 ℃； 2：發酵溫度28 ℃；3：發酵溫度30 ℃； 4：發酵溫度32 ℃

圖3　發酵溫度對海參i-型溶菌酶的表達

2.5海參i-型溶菌酶的純化

發酵結束后離心收集上清液，用于后期純化。各純化步驟的電泳分析結果如圖5所示。與空白對照(泳道1)比較，發酵上清液(泳道2)在14.3kD處呈現明顯的目的蛋白表達條帶，這與理論計算的海參i-型溶菌酶分子量大小相一致。通過離子交換層析純化后大部分雜蛋白被除去，目的蛋白占總蛋白的70%，達到初步分離的效果(泳道3)。通過凝膠過濾層析進一步純化后，海參i-型溶菌酶占總蛋白90%以上(泳道4)。通過測定純化后酶液中蛋白含量和溶菌酶活性，計算出海參i-型溶菌酶比活力為826.44 U/mg。

2.6海參i-型溶菌酶抑菌活性分析

采用牛津杯法檢測純化后的海參i-型溶菌酶的抑菌活性，結果如圖6所示。經測量溶壁微球菌的抑菌直徑為16 mm，副溶血弧菌的抑菌直徑為14 mm。副溶血弧菌是威脅水產養殖業的主要病原菌之一，進食含有該菌的食物可致食物中毒，純化后的溶菌酶對這兩種指示菌均具有抑菌性。該實驗結果為海參i-型溶菌酶的應用提供了更廣闊的前景。

M： Marker； 1：第0 h； 2：第24 h；3：第48 h； 4：第72 h；5：第96 h； 6：第120 h

圖4　發酵時間對海參i-型溶菌酶的表達

M：Marker； 1：不含海參溶菌酶基因的重組畢赤酵母發酵液；2：海參i-型溶菌酶畢赤酵母基因工程菌發酵上清液；3：離子交換柱CM Sepharose Fast Flow純化后的粗酶液；4：凝膠過濾柱Sephacryl S-100 High Resolution純化后的海參i-型溶菌酶

圖5純化后海參i-型溶菌酶的SDS-PAGE電泳分析

3結論

溶菌酶具有抗菌和抗病毒的作用，這使其在食品防腐、醫學治療和畜牧養殖等領域中擁有巨大的應用價值。目前已有大量關c-型溶菌酶的研究，然而c-型溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抑菌效果具有局限性[16]。本實驗所研究的海參i-型溶菌酶對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有明顯的抑菌效果，這為該溶菌酶作為抗生素代用品應用于水產養殖提供了可能性。

相關研究表明，通過對發酵條件的優化可以增加畢赤酵母表達外源蛋白的產量[17]。本實驗為提高海參i-型溶菌酶在畢赤酵母基因工程菌中表達水平，對發酵條件進行優化。確定最佳條件為發酵培養基初始pH為6.0，溫度30 ℃，每24 h添加終濃度為1.0%甲醇，發酵時間96 h。實驗結果得到發酵液中海參i-型溶菌酶的表達量為10.63 mg/L，純化后酶的純度達到90%以上，比活力826.44 U/mg。 該研究為進一步放大生產海參溶菌酶奠定基礎，目前發酵罐逐級放大生產該酶正在試驗中。

參考文獻

[1]Jollès P，Jollès J．What's new in lysozyme research? Always a model system，today as yesterday[J]．Molecular and Cellular Biochemistry，1984，63(2)：165-89．

[2]Supungul P，Rimphanitchayakit V，Aoki T，etal．Molecular characterization and expression analysis of a c-type and two novel muramidase-deficient i-type lysozymes fromPenaceusmonodon[J]．Fish and Shellfish Immunology，2010，28(3)：490-498．

[3]Liburdi K，Benucci I，Esti M．Lysozyme in Wine：An Overview of Current and Future Applications[J]．Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2014，13(5)：1062-1073．

[4]Jollès J，Jollès P．The lysozyme fromAsteriasrubens[J]．European Journal of Biochemistry，1975，54(1)：19-23．

[5]Xin Y，Liu B，Xue Q．An i-type lysozyme from the Asiatic hard clamMeretrixmeretrixpotentially functioning in host immunity[J]．Fish and Shellfish Immunology，2011，30(2)：550-558．

[6]Ding JF，Wang R，Yang F，etal．Identification and characterization of a novel phage-type like lysozyme from Manilaclam,Ruditapesphilippinarum[J]．Developmental and Comparative Immunology，2014，47(1)：81-89．

[7]Cong LN，Yang XJ，Wang XX，etal．Characterization of an i-type lysozyme gene from the sea cucumberStichopusjaponicus，and enzymatic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein[J]．Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，107(6)：583-588．

[8]王秀霞，叢麗娜，王丹等．海刺參i 型溶菌酶基因的重組表達及抑菌譜分析[J]．生物工程學報，2009，25(2)：189-194．

[9]Ahmad M，Hirz M，Pichler H，etal．Protein expression inPichiapastoris：recent achievements and perspectives for heterologous protein production[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98(12)：5301-5317．

[10]Wang N，Wang YJ，LI GQ，etal．Expression，characterization，and antimicrobial ability of T4 lysozyme from methylotrophic yeastHansenulapolymorphaA16[J]．Science China，2011，54(6)：520-526．

[11]Zhou XY，Yu Y．Production of LYZL6，a novel human c-type lysozyme，in recombinantPichiapastorisemploying high cell density fed-batch fermentation[J]．Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，118(4)：420-425．

[12]谷躍峰，叢麗娜，駱寧．海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達與純化[J]．大連工業大學學報，2010，29(5)：317-320．

[13]袁東華，蔡國林，任曉靜等．重組畢赤酵母產木聚糖酶的發酵條件優化研究[J]．工業微生物，2012，42(1)：39-44．

[14]Yu Y，Zhou X，Wu S，etal．High-yield production of the human lysozyme byPichiapastorisSMD1168 using response surface methodology and high-cell-density fermentation[J]．Electronic Journal of Biotechnology，2014，17(6)：311-316．

[15]茍萬曉，衛紅偉，胡元森等．畢赤酵母發酵生產甲醇蛋白工業條件的優化[J]．中國釀造，2014，33(7)：78-83．

[16]Vaughan NH，Smith SL．Isolation and characterization of a c-type lysozyme from the nurse shark[J]．Fish and Shellfish Immunology，2013，35(6)：1824-1828．

[17]李青，周曉宏．新型生物防腐劑—多聚陽離子抗菌肽在畢赤酵母中的表達[J]．食品科學，2013，34(5)：161-166．

Optimization of fermentation conditions for i-type lysozyme produced by recombinantPichiapastoris

MA Jun, ZHANG Yang, CONG Li-na, LI Cheng

School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

AbstractIn this study, the genetic strain Pichia pastoris pPIC9K-SjLys/GS115 (SjLys) was used to produce the i-type lysozyme from sea cucumber Apostichopus japonicus. The fermentation conditions were optimized for enhancement of i-type lysozyme production. The results showed that the maximum i-type lysozyme yield of 10.63 mg/L was achieved under the conditions of initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃, fermentation time 96 h and methanol concentration of 1%. The fermentation culture of SjLys was centrifuged and concentrated by ultra-filtration, then purified by cation exchange and gel filtration chromatography. The specific activity of the purified i-type lysozyme was 826.44 U/mg. The purified SjLys product diaplayed inhibitive effects on the growth of the gram-positive bacterium Micrococcus lysodeikticus and gram-negative bacterium Vibrio parahemolyticus.

Key wordsi-type lysozyme; Pichia pastoris; optimization; enzyme activity

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.008

基金項目：遼寧省教育廳重點實驗室(LZ2014029)，遼寧省研究生教育創新計劃項目(2014-154)，國家海洋食品工程技術研究中心開放實驗室(2012FU125X03)。

作者簡介：馬俊(1990～)，男，碩士研究生。E-mail:majun617@163.com。 *通訊作者：叢麗娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com。