界面介質對木醋桿菌產細菌纖維素的影響

湯衛華，賈士儒

（1.天津現代職業技術學院生物工程學院，天津　300350；2.天津市工業微生物重點實驗室，天津　300457）

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界面介質對木醋桿菌產細菌纖維素的影響

湯衛華1，賈士儒2

（1.天津現代職業技術學院生物工程學院，天津300350；2.天津市工業微生物重點實驗室，天津300457）

摘要：為了提高靜置培養條件下木醋桿菌發酵生產細菌纖維素的產量，考察在培養基中添加界面介質（紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜）對細菌纖維素合成的影響。結果表明，聚氨酯薄膜材料的面積為培養基液面1/2時，細菌纖維素產量是對照組的1.51倍；同時發現這些界面介質提高細菌纖維素產量的原因是主要副產物乙酸和葡萄糖酸的產量降低。這表明界面介質能夠限制氧氣的傳遞，阻止葡萄糖氧化成為葡萄糖酸，使碳源流主要流向細菌纖維素合成途徑。

關鍵詞：細菌纖維素；界面介質；木醋桿菌；產量

細菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是某些細菌合成的高分子化合物，具有超精細網狀結構，雖然BC和植物或海藻產生的纖維素具有相同的分子結構單元，但BC卻具有很多獨特的性質，如高結晶度、高化學純度、高抗張強度、高彈性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可調控性等［1］，這些性質是其他來源纖維無法比擬的。

雖然BC的發現至今已有100多年的歷史，但由于生產成本高，以至其應用受到限制。為了提高BC的產量，除了很多學者在菌種選育、發酵工藝、發酵裝置等方面進行了大量研究以外，有學者在動態培養條件下添加增稠劑，如海藻酸鈉［2］、瓊脂［3-4］、明膠和Polyacry Lamide-coacrylic acid（PCA）［5］來提高BC的產量。E J Vandamme發現在培養基中加入一些不溶于水的小顆粒物質（沙子、硅藻土或者玻璃球等），可阻止葡萄糖變成葡萄糖酸，提高BC產率。而在靜置培養條件下，添加這些物質對細菌纖維素膜合成的影響探討較少。基于在靜置培養條件下得到的細菌纖維素膜具有良好的成膜性，能更好地應用于一些對成膜性要求較高的領域，如醫用行業、膜材料等。為了提高靜置培養條件下BC的產量，在前期培養基和培養條件優化的基礎上，研究界面介質對木醋桿菌產細菌纖維素的影響，并且初步探討其機理。

1　試驗材料和方法

1.1菌種

木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus），天津市工業微生物重點實驗室保藏。

1.2培養基和培養方法

1.2.1培養基

液體培養基（g/L）：胰蛋白胨5，酵母粉5，檸檬酸1，葡萄糖20，Na2HPO45，pH值6.0。于121℃條件下滅菌20 min；固體培養基（g/L）：同上，瓊脂20。

1.2.2培養方法

種子培養：取1環活化好的斜面種子接入液體培養基，于30℃條件下振蕩培養24～30 h，搖床轉速為160 r/min，作為種子。

1.3分析方法

1.3.1細菌纖維素提取和處理方法

培養結束后將膜取出，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質。再將膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，于100℃條件下煮沸20 min，去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，約7.2。80℃干燥至恒質量，進行稱質量。纖維素的產量表示為纖維素（g）/培養基（L）。

1.3.2菌體量的測定

用0.85%的生理鹽水配制pH值為4.6～4.8的0.1 mol/L醋酸鉀-醋酸緩沖溶液100 mL，取纖維素酶2 g放入緩沖溶液中活化，置冰箱備用。測定時，每次取活化好的纖維素酶溶液2 mL在50℃，pH值為5.0條件下充分水解2 h，適當稀釋后，于600 nm波長下測吸光度OD600值。

1.3.3葡萄糖酸和乙酸的測定

葡萄糖酸和乙酸使用HPLC檢測［6］，采用C18型反相柱（250 mm×4.6 mm），流動相為0.05 mol/L KH2PO4；流速為1 mL/min；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL。

2　結果與討論

2.1不同的界面介質對BC產量的影響

選取不溶于水的、可高溫滅菌且可反復利用的外源介質（如紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜材料），平放于培養皿中濕熱滅菌備用。接種量為6%（V/V），培養時間為6 d，考察這些不同來源的界面介質對木醋桿菌生物合成細菌纖維素的影響。

培養基中添加不同的界面介質對BC產量以及菌體生長的影響見圖1。

圖1　培養基中添加不同的界面介質對BC產量以及菌體生長的影響

由圖1可知，不同來源的介質均能促進菌體的生長和細菌纖維素的生物合成，可能這些介質為木醋桿菌的生長提供了良好的生長界面，因此促進了菌體的大量生長，繼而生物合成更多的細菌纖維素。其中，聚氨酯薄膜對細菌纖維素產量影響最大，細菌纖維素產量達到5.63 g/L，是對照組的1.32倍；其次為玻璃紙薄膜、濾布和紗布。

2.2界面介質面積對BC產量的影響

在直徑90 mm的平皿中分別放入直徑為90 mm（63.6 cm2即平皿面積）、64 mm（31.8 cm2即平皿面積的1/2）和22.5 mm（15.9 cm2即平皿面積的1/4）的聚氨酯薄膜，考察不同的聚氨酯薄膜面積對BC生物合成和菌體生長的影響。

不同的介質面積對細菌纖維素產量和菌體量的影響見表1。

表1　不同的介質面積對細菌纖維素產量和菌體量的影響

由表1可知，介質的面積對細菌纖維素的產量和菌體量都有影響，其中直徑為64 mm的介質，即介質面積為整個培養液面面積的1/2時，BC產量最高，達到5.79 g/L，是對照組的1.51倍；其次是直徑為90 mm的介質，其BC產量為5.31 g/L；最后是直徑為22.5 mm的介質，其BC產量為4.48 g/L。不同的介質面積對BC產量影響較大的原因，可能是一方面介質為木醋桿菌的生長提供良好的生長面，同時這些介質又會影響營養物質和氧氣的傳遞。當介質面積為31.8 cm2時，既能為菌體生長提供良好的附著面，又能供給菌體生長需要的氧氣和營養物質，因此促進細菌纖維素的生物合成和菌體的大量生長。

2.3機理分析

研究發現，加入直徑為64 mm的聚氨酯薄膜材料后，對細菌纖維素的產量有明顯的促進作用。在原有培養基配方的基礎上，添加聚氨酯薄膜材料后，考察這些因素對木醋桿菌主要代謝產物產量的影響。

木醋桿菌代謝產物分析見表2。

由表2可知，在培養基中加入聚氨酯薄膜后，對木醋桿菌代謝途徑有明顯的影響，副產物乙酸和葡萄糖酸的產量下降。這可能是培養基中添加這些非營養性物質后，能夠限制氧氣的傳遞，使葡萄糖酸的生物合成下降，使更多的碳源用于BC的生物合成和菌體的生長。

表2　木醋桿菌代謝產物分析

3　結論

培養基中放置紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜后，均能明顯地提高BC產量，其中聚氨酯薄膜的效果更佳。聚氨酯薄膜的面積為培養基液面1/2時，BC產量達最高，是對照組的1.51倍。究其原因，是由于這些界面介質能夠限制氧氣的傳遞，阻止葡萄糖氧化成為葡萄糖酸，使碳源流主要流向BC合成途徑，因此BC產量大幅度提高。

參考文獻：

［1］湯衛華，李飛，賈媛媛，等.細菌纖維素高產菌株的誘變選育和發酵條件的研究［J］.現代食品科技，2009（9）：1 016-1 019.

［2］Zhou L L，Sun D P，Hu L Y，et al.Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001，34（7）：483-489.

［3］Kuan Chencheng，Jeffrey M，Catchmark，et al.Effect of different additives on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum and analysis of material property［J］. Cellulose，2009（16）：1 033-1 045.

［4］Sangok Bae，Yasushi Sugano，Makoto Shoda.Improvement of bacterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，1997（1）：33-38.

［5］Gerard Joseph，Geralad E Rowe，Argrios Margaritis，et al.Effects of polyacrylami de-co-acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1978（2）：964-970.

［6］李飛，謝中華，湯衛華，等.細菌纖維素生物合成網絡的構建及代謝通量分析［J］.天津科技大學學報，2009（3）：6-9.

Effect of Media Interface on the Production of Bacterial Cellulose from Acetobacter Xylinum

TANG Weihua1，JIA Shiru2
（1.Department of Chemical Biology，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory，Tianjin 300457，China）

Abstract：In order to improve the production of bacterial cellulose fermentation on the static culture，several media interfaces such as gauze，filter cloth，polyurethane film and cellophane film are appended in substrate.The effect of media interface on the production of bacterial cellulose from Acetobacter xylinum is investigated.The results show that the yield of bacterial cellulose is 1.51 times higher than the control group when the area of the polyurethane film is half of the medium liquid level. At the same time，it is found that the increase of the yield of bacterial cellulose is mainly due to the decrease of the yield of acetic acid and glucose.This indicates that the interface medium can restrict the transfer of oxygen，prevent oxidation of glucose into glucose acid，so that more carbon source flow to bacterial cellulose biosynthesis.

Key words：bacterial cellulose；media interface；Acetobacter xylinum；yield

中圖分類號：TQ352.4；Q933

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.05.043

文章編號：1671-9646（2016）05b-0052-02

收稿日期：2016-04-01

作者簡介：湯衛華（1979—），女，博士，教授，研究方向為生物化工。