安化黑茶對高脂血癥大鼠主動脈核因子-κB的影響*

湯　艷　易　健　彭千元　吳琨鵬　周勝強　劉柏炎（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410000）

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安化黑茶對高脂血癥大鼠主動脈核因子-κB的影響*

湯艷易健彭千元吳琨鵬周勝強劉柏炎△
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410000）

【摘要】目的觀察安化黑茶對高脂血癥大鼠主動脈核因子-κB（NF-κB）的影響。方法60只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組10只和造模組50只，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)12周，同時，維生素D3腹腔注射。12周后斷尾采血，檢測大鼠血脂，驗證模型是否成功。將造模成功的造模組大鼠先分層后隨機分組，每組10只，對照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃；黑茶低、中、高劑量組及阿托伐他汀組分別按其對應(yīng)濃度灌胃4周，并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。實驗結(jié)束后采用免疫組化法與RT-PCR的方法檢測胸主動脈NF-κB表達水平。結(jié)果本實驗可以成功制備高脂血癥模型。安化黑茶干預(yù)后NF-κB表達水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但組間差異未達到統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論安化黑茶能抑制高脂血癥大鼠主動脈NF-κB蛋白和基因的表達。

【關(guān)鍵詞】黑茶高脂血癥核轉(zhuǎn)錄因子-κB炎癥

動脈粥樣硬化（AS）作為心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)［1］，其發(fā)病機制尚未完全明確，但脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說和慢性炎癥學(xué)說已得到普遍公認。炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，這方面研究頗多，然而高脂血癥與炎癥反應(yīng)這方面研究卻有限。近代研究發(fā)現(xiàn)安化黑茶具有降脂作用，其是否具有抗炎作用卻不明確，本實驗擬從高脂血癥與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的關(guān)系入手，研究和探討安化黑茶對高脂血癥大鼠NF-κB的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物6.0只雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003。實驗環(huán)境：湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，溫度20～22℃，相對濕度50%～60%。

1.2藥物與試劑黑茶購自于白沙溪茶廠天茯茶（1000g）。阿托伐他汀鈣膠囊（尤佳，國藥準字：H20070054）。維生素D3注射液（哈爾濱宏達動物藥品廠，生產(chǎn)批號20140303），NF-κB P50、P65抗大鼠單克隆抗體（abcam公司），SABC試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉試劑公司），水合氯醛、多聚甲醛、檸檬酸鹽（北京鼎國生物公司），Trizol（ambion），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）；qPCR試劑盒（TaKaRa），引物（上海生工）。高脂飼料：按文獻［2］加以改進配制高脂飼料（3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%豬油、5%白糖、86.3%標準飼料）。

1.3實驗儀器半自動生化分析儀（美國Rayto生產(chǎn)）；高速冷凍離心機（德國）；電腦程控組織脫水機（襄樊徠克生物電子儀器廠）；自動雙重純水蒸餾器（上海玻璃儀器一廠）；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；BX43奧林巴斯熒光顯微鏡及IPP6.0圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（eppendorf）；核酸蛋白濃度測定儀、核酸水平電泳儀（Bio Drop）；梯度PCR擴增儀（Bio-RAD）等。

1.4模型制備大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，先按體質(zhì)量分層后隨機分為正常組（10只）和造模組（50只），對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予自制高脂飼料喂養(yǎng)，自然攝食，連續(xù)喂養(yǎng)12周。同時，造模組在造模前一次性腹腔注射維生素D360萬IU/kg，造模后3、6、9周各補充維生素D310萬IU/kg腹腔注射［2］，正常組同時給予等體積的生理鹽水腹腔注射。12周后禁食不禁水12h斷尾采血，2000r/min，4℃離心10min，分離血清。半自動生化儀檢測兩組血清血脂水平，造模組血脂各指標顯著升高具有統(tǒng)計學(xué)意義者，確定模型建立成功。造模后，與正常組比較，造模組大鼠血清TC、TG、LDL-C升高達到顯著水平（P＜0.01），HDL-C下降達到顯著水平（P＜0.01），驗證模型成功。

表1　造模后血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1　造模后血脂水平比較（mmol/L，±s）

與正常組比較，*P＜0.01。

組別　LDL-C　HDL-C正常組　1.05±0.28　1.35±0.15模型組　27.03±2.26*0.97±0.15*n1050TC　TG 2.74±0.431.03±0.2034.50±3.33*2.48±0.54*

1.5給藥方法黑茶推薦量為成人（按體質(zhì)量60kg計）干茶10g/d［3］，將黑茶原料處理成碎狀，按每克茶葉加12mL沸水進行煎煮，武火煎至沸騰后改文火，繼續(xù)煎煮20min，取汁另置。繼續(xù)加水，量較第1次稍少，煎煮沸騰后，文火續(xù)煎20min，取汁，兩次茶水合并后按以下濃度濃縮。離心機去除殘渣，4℃保存。造模成功后，按血脂水平分層后隨機分為5組，每組10只。黑茶高劑量組為2.03 mg/kg、黑茶中劑量組為1.015 mg/kg、黑茶低劑量組為0.5075 mg/kg、阿托伐他汀組為10mg/kg［4］，正常組和模型組給予用藥組等體積蒸餾水灌胃；灌胃量為5 mL/（kg·d），每天上午10∶00一次性給藥，連續(xù)灌胃4周。以上劑量均采用成人體質(zhì)量60kg體表面積換算法。

1.6標本采集與檢測

1.6.1胸主動脈NF-κB蛋白表達變化檢測實驗結(jié)束，禁食不禁水12h，大鼠以10%水合氯醛（4.0mL/kg）腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血約5 mL備用，后自主動脈弓根部向下剪至腹主動脈分叉處，剝離結(jié)締組織，生理鹽水沖洗干凈，將組織放在4%多聚甲醛中備用。每組選取4只大鼠胸主動脈，石蠟包埋，切片，烤片，常規(guī)脫蠟；檸檬酸鹽液高溫高壓修復(fù)2min，3%H2O2孵育10min；PBS沖洗3 min×3次；滴加正常山羊血清孵育15 min，后傾去；滴加一抗（NF-κB P50、P65稀釋比例均為1∶200），4℃過夜；PBS沖洗3 min×3次；滴加二抗室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素室溫15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，自來水充分沖洗，脫水，中性樹膠封片。應(yīng)用Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡，400倍鏡下隨機選取10個不重復(fù)的視野，由圖像分析系統(tǒng)計數(shù)平均光密度。

1.6.2胸主動脈NF-κB mRNA表達變化檢測使用Trizol提取RNA，采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR擴增。根據(jù)各基因序列設(shè)計引物：β-actin 5′-ACAA CCTTCTTGCAGCTCCTC-3′，5′-CTGACCCATACCCAC CATCAC-3′；NF-κB P505′-GGACAACTATGAGATGA GCTCCG -3′，5′-GCTGAGTTTGCGGAAGGATG -3′；NF-κB P655′-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3′，5′-TC ACTGAGCTC CCGATCAGA-3′。每個樣本做3個平行反應(yīng)后取平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料測定以（±s）表示，指標測定值先進行正態(tài)性檢驗后選擇檢驗方法，多組間均數(shù)比較方差齊者用單因素方差分析，組間兩組比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnet’s T3法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1黑茶對實驗大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65蛋白表達的影響見圖1，圖2，表2。NF-κB P50、P65陽性表達主要表現(xiàn)為細胞胞質(zhì)中棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物。實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠主動脈NF-κB P50、P65陽性反應(yīng)物棕色顆粒顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明長期高脂血癥可以促進NF-κB的釋放和表達，模型有意義。干預(yù)后各治療組大鼠主動脈NF-κB P50、P65棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物明顯減少，與模型組比較，黑茶高、中、低劑量組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65陽性細胞光密度值水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　各組大鼠胸主動脈炎癥因子κB P50水平表達（免疫組化，400倍）

圖2　各組大鼠胸主動脈炎癥因子κB P65水平表達（免疫組化，400倍）

表2　各組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65蛋白水平比較（OD，±s）

表2　各組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65蛋白水平比較（OD，±s）

與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　NF-κB P50　NF-κB P65正常組　10　0.68±0.08*　0.68±0.05*模型組　10　2.03±0.09▲　1.89±0.19▲阿托伐他汀組　10　1.15±0.25*▲　0.76±0.08*黑茶高劑量組　10　1.62±0.33*▲　1.05±0.33*△黑茶中劑量組　10　1.30±0.21*▲　0.79±0.16*黑茶低劑量組　10　1.37±0.16*▲　0.99±0.26*▲

2.2黑茶對實驗大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65基因表達的影響見表3，圖3。與正常組比較，模型組大鼠主動脈NF-κB P50、P65 mRNA相對表達量比較顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），再次說明長期高脂血癥可以促進NF-κB的釋放和表達，模型有意義。經(jīng)治療后與模型組比較，黑茶高、中、低劑量組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65 mRNA相對表達量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與采用免疫組化法檢測NF-κB蛋白表達結(jié)果大致相同。

3　討　論

脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說和慢性炎癥學(xué)說都是AS主要發(fā)病學(xué)說，而在AS的炎癥反應(yīng)學(xué)說中，其化學(xué)反應(yīng)學(xué)說［5］對兩者關(guān)系進行了詳細描述，脂質(zhì)可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。研究證實，長期高脂血癥作用下，可損傷血管內(nèi)皮細胞，LDL-C可以通過受損內(nèi)皮進入血管內(nèi)膜，并氧化修飾成低密度脂蛋白膽固醇（ox-LDL-C），ox-LDL能進一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、失衡，促進內(nèi)皮細胞內(nèi)氧化脂質(zhì)的積累，活化氧化應(yīng)激反應(yīng)以及前炎癥因子釋放，如TNF-α、IL-10、CRP等，這些炎癥因子能夠加快NF-κB的激活與釋放［6-8］，而NF-κB又能進一步加重炎癥因子的釋放，加速內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積。研究也表明，NF-κB能調(diào)控多種炎癥因子，參與炎癥過程中的多種信號傳導(dǎo)途徑［5］，如MAPK依賴性信號通路：致炎物質(zhì)的配體首先激活相應(yīng)受體，通過激活MAPK分子，導(dǎo)致NF-κB活化，從而調(diào)節(jié)炎性細胞因子的表達；TLR依賴性信號通路、ROS依賴性信號通路，同樣可以使致炎物激活相應(yīng)受體，使TLR或ROS活化NF-κB，促進炎性細胞因子的合成和釋放。綜上所述，高脂血癥能促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，而NF-κB參與炎癥反應(yīng)多信號傳導(dǎo)途徑，在AS發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。

表3　各組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65 mRNA相對表達量比較（2-△△CT，±s）

表3　各組大鼠胸主動脈NF-κB P50、P65 mRNA相對表達量比較（2-△△CT，±s）

組別　n　NF-κB P50　NF-κB P65正常組6.　0.07±0.08　0.02±0.02模型組6.　9.24±6.39▲　1.01±0.16▲阿托伐他汀組6.　1.13±0.72*　0.30±0.14*黑茶高劑量組6.　2.17±0.84*　0.45±0.28*黑茶中劑量組6.　1.45±0.40*　0.25±0.07*黑茶低劑量組6.　1.58±0.38*　0.46±0.28*

圖3　各組大鼠胸主動脈NF-κB p50、p65 mRNA相對表達量

隨著黑茶產(chǎn)業(yè)的興起，尤其是安化黑茶中“金花”冠突散囊菌的發(fā)現(xiàn)，其藥用價值開始受到大眾的關(guān)注。近年來茶葉界對其成分及其療效研究頗多，研究表明，安化黑茶作為一類后發(fā)酵茶可以通過多途徑產(chǎn)生降脂效用，如傅冬和、宋魯彬等［9-10］研究表明其可通過激活PPARγ、PPARδ等途徑產(chǎn)生降脂效用；杜萬紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)黑茶能降低高脂血癥大鼠血清血脂水平，保護血管內(nèi)皮，其機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)ADMA/NO系統(tǒng)有關(guān)。然而安化黑茶能否產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)和其他效用并不明確。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：通過高脂飲食+腹腔注射維生素D3的方法可以成功制備高脂血癥模型，且模型組NF-κB蛋白和基因表達均顯著上升，說明高脂血癥聯(lián)合維生素D3可以促進NF-κB活化與釋放，促進炎癥的產(chǎn)生。實驗同時發(fā)現(xiàn)，黑茶組能抑制高脂血癥大鼠主動脈NF-κB蛋白和基因的表達，蛋白與基因的表達相對一致。實驗提示安化黑茶降脂、抑制炎癥反應(yīng)，可能與調(diào)控NF-κB的表達有關(guān)。

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中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0390-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.005

*基金項目：湖南省財政廳資助項目（湘財教指［2013］240號）

通信作者△（電子郵箱：liubaiyan＠126.com）

收稿日期（2015-11-29）

In fluence of Dark Tea on Aortal NF -κB of Rats with Hyperlipidemia

TANG Yan，YI Jian，PENG Qianyuan，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410000，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of dark tea on aortal NF-κB of hyperlipidemia rat.Methods：60male SD rats were randomly divided into the control group（n =10）and the model group（n = 50）.The control group were fed with normal diet，and the model group were fed with high fat diet for12weeks.Intraperitoneal injection of VitD3was used in the preparation of hyperlipidemia rat model.After12weeks，the tail blood of rats were used to detect blood lipid，so as to test if the model was successful.After the model was successfully established，the rats in the model group were randomly divided，10in each group.The control group and the model group were given equal volume of distiued water.Low，medium and high dose of dark tea group and Astorvastatin，respectively according to their corresponding concentration，received lavage for 4 weeks，and continued high fat feed.Immunohistochemical and RT-PCR methods were used to test aortal NF-κB expression level.Results：This experiment could successfully prepare hyperlipidemia model.Dark tea decreased NF-κB expression level after intervention，and the difference was statistically significant（P＜0.05），but the difference between groups did not reach statistical significance（P＞0.05）.Conclusion：Dark tea can inhibite the expression of hyperlipidemia rat aortal NF-κB protein and gene.

【Key words】Dark tea；Hyperlipidemia；Nuclear transcription factor κB；Inflammation