兩種軟骨終板細胞體外培養方法效果的比較研究*

湯小康　李　敏　應　航　盧　敏（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙40007；.浙江中醫藥大學醫學技術學院，浙江杭州30053）

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兩種軟骨終板細胞體外培養方法效果的比較研究*

湯小康1△李敏2應航2盧敏1
（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.浙江中醫藥大學醫學技術學院，浙江杭州310053）

【摘要】目的比較原代椎間盤軟骨終板細胞實驗室培養中Ⅰ型與Ⅱ型膠原酶消化效率的差異。方法提取新西蘭大白兔椎間盤軟骨終板組織，將其剪碎并隨機分成2等份，標記為Ⅰ型膠原組和Ⅱ膠原型組；用0.25%的胰蛋白酶預消化后，分別用0.02%Ⅰ型膠原酶和0.02%Ⅱ型膠原酶在37℃消化3次，每次1 h；將3次消化所得的細胞懸液混勻后離心，獲取細胞并進行培養與傳代；對兩組軟骨終板細胞分別進行細胞計數、細胞形態學觀察和細胞增殖情況檢測等處理，比較兩組軟骨終板細胞數目、形態及增殖情況的差異。結果1）細胞計數：Ⅰ型膠原組細胞3次細胞計數結果分別為5.75×104個/mL、5.50×104個/mL、6.25×104個/mL，獲得軟骨終板數目（5.83±0.31）×104個/mL；Ⅱ膠原型組細胞3次細胞計數結果分別為8.75×104個/mL、9.50×104個/mL、8.25×104個/mL，獲得軟骨終板數目（8.83±0.51）×104個/mL，Ⅰ型膠原組細胞總量明顯少于Ⅱ膠原型組；2）細胞形態：兩組軟骨終板細胞多呈多角形，胞核大而圓，形態無明顯差異。3）細胞增殖：Ⅰ型膠原組細胞MTT讀數OD值為（0.561±0.003），Ⅱ膠原型組細胞MTT讀數OD值為（0.562±0.002），組間差異無統計學意義（P > 0.05）。結論Ⅱ型膠原酶較Ⅰ型膠原酶更適用于原代椎間盤軟骨終板細胞的分離培養。

【關鍵詞】軟骨終板細胞Ⅰ型膠原酶Ⅱ型膠原酶細胞培養

椎間盤源性腰痛臨床患病率較高，病情典型者嚴重影響患者日常生活，其屬于中醫學“腰痛”范疇，益氣補腎是中醫治療腰痛的基本方略之一［1］。現代醫學研究認為，椎間盤的退變與頸、腰椎疾病的發生密切相關［2］，軟骨終板退變是導致椎間盤退變的始動因素［3］。隨著對脊柱退行性疾病研究的深入，針對軟骨終板細胞的研究也日益豐富。如何在實驗室高效獲得椎間盤軟骨終板細胞，對研究中藥干預“腰痛”的具體機制有著極為重要的意義。有研究指出Ⅱ型膠原是椎間盤細胞外基質表達的特征性產物［4］，因此有理由相信Ⅱ型膠原酶在原代椎間盤軟骨終板細胞分離培養中具有獨特優勢。為驗證Ⅱ型膠原酶在軟骨終板細胞培養中的效率優勢，本實驗選取了實驗室常用于細胞消化分離培養的Ⅰ型膠原酶作為參照，進行了相關研究。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物4周齡新西蘭大白兔4只，雌雄各2只，體質量0.5～0.75 kg，清潔級，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。實驗動物合格證號：XL202081、室溫飼養。

1.2主要試劑、儀器和材料胰蛋白酶（Gbico）、Ⅰ型膠原酶（Sigma）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、PBS緩釋液（吉諾生物醫藥技術有限公司）、DMEM培養液（吉諾）、胎牛血清（四季青）、潔凈工作臺（Airtech）、普通手術器械、眼科手術器械、電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）、臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、天枰、計數板及計數器、6孔培養板（NEST）、96孔培養板（NEST）、培養箱（Thermo）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、BioTek 800酶標儀（美國BioTek公司）等。

1.3椎間盤軟骨終板細胞體外的分離與培養

1.3.1椎間盤軟骨終板的取材及預消化兔耳緣靜脈水合氯醛過量給藥處死新西蘭大白兔，背部備皮，75%酒精消毒后鋪巾，沿后正中線切開皮膚，分離椎旁肌肉，取下頸胸腰段脊柱；在超凈臺中剔除脊柱周圍肌肉組織及筋膜，用0.01 mol/L PBS沖洗至無明顯血跡，分離椎間盤軟骨終板組織，置于PBS溶液中，待所有軟骨終板取好后用培養液洗兩遍，分別用眼科剪剪成1 mm×1 mm的小塊，用天枰將其分為兩等份，并分別轉移入50mL無菌離心管中，加入15 mL 0.25%胰蛋白酶進行預消化，37℃水浴中放置30min，1000r/min離心5 min，保留組織塊及沉淀，去上清液。

1.3.2Ⅰ型膠原酶與Ⅱ型膠原酶的干預將兩組椎間盤軟骨終板組織隨機標記為Ⅰ型膠原組與Ⅱ膠原型組，分別以5 mL 0.02%Ⅰ型膠原酶和0.02%Ⅱ型膠原酶37℃水浴中消化1 h，將含細胞的消化液以1000r/min離心8 min，棄上清液，沉淀的細胞團塊用DMEM培養液（含10%胎牛血清）吹打混勻。剩余骨片再加入5 mL新的同類膠原酶繼續消化1 h，重復以上步驟3次。

1.4細胞接種與傳代將3次消化所得的兩組軟骨終板細胞各自充分混勻并進行3次計數，計數結束后將其接種于2塊6孔培養板中，置于37℃5%CO2培養箱中培養。48 h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并換液1次，此后每隔36h換液1次。顯微鏡下觀察細胞長至皿底的60%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，計數后將兩組軟骨終板細胞稀釋至5.0×105個/mL，均勻接種于6孔和96孔培養板中傳代培養。

1.5指標觀察1）細胞計數：原代軟骨終板細胞混懸液接種前，分別從兩組充分混勻的細胞混懸液中吸取適量細胞懸液，置于清潔計數板上計數，分別計數3次。細胞數（個/mL）=4個大格細胞數/4×10000。2）細胞形態：原代軟骨終板細胞培養48 h后，將兩組盛有軟骨終板細胞的6孔培養板置于倒置相差顯微鏡下進行觀察、拍照。第2代軟骨終板細胞培養48 h后，將兩組盛有軟骨終板細胞的6孔培養板置于倒置相差顯微鏡下進行細胞形態觀察并拍照。3）細胞增殖：第2代軟骨終板細胞培養48 h后，從盛有兩組盛有軟骨終板細胞的96孔培養板中各選6個培養孔，分別加入10mL MTT溶液，37℃繼續孵育4 h后吸棄培養液，再加入100μL MTT溶解劑，于570nm波長處測定兩組軟骨終板細胞的光密度（OD）。

1.6統計學處理采用SPSS18.0統計軟件分析。兩組軟骨終板細胞OD值組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1兩組軟骨終板細胞計數結果比較見表1。3次細胞計數結果顯示，Ⅱ型膠原組軟骨終板細胞數明顯多于Ⅰ型膠原組。

表1　兩組軟骨終板細胞計數結果比較（個/mL）

2.2兩組細胞形態比較見圖1。圖A中Ⅰ型膠原組原代軟骨終板細胞培養48 h可見部分細胞貼壁，大部分細胞懸浮，貼壁細胞為多角形，胞核大而圓，有2～3個核仁（400倍）；圖B中Ⅱ型膠原組原代軟骨終板細胞培養48 h部分細胞貼壁，可見懸浮細胞，貼壁細胞呈現多角形，胞核大而圓，有2～3個核仁（400倍）。圖C中Ⅰ型膠原組第2代軟骨終板細胞培養48 h大部分細胞貼壁，少許細胞懸浮，貼壁細胞為多角形（200倍）；圖D中Ⅱ型膠原組第2代軟骨終板細胞培養48 h大部分細胞貼壁，少許細胞懸浮，貼壁細胞呈多角形（200倍）。兩組原代軟骨終板細胞培養48 h，顯微鏡下觀察見部分細胞貼壁，外觀呈多角形，胞核大而圓，有2～3個核仁，胞漿豐富，含少許分泌顆粒，兩組軟骨終板細胞形態無明顯差異；兩組第2代軟骨終板細胞培養48 h，顯微鏡下觀察見大部分細胞貼壁，外觀呈多角形，胞核大而圓，有2～3個核仁，胞漿豐富，含分泌顆粒，兩組軟骨終板細胞形態亦無明顯差異。

2.3細胞增殖Ⅰ型膠原組第2代軟骨終板細胞MTT讀數OD值為（0.561±0.003）與Ⅱ型膠原組第2代軟骨終板細胞OD值（0.562±0.002）比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

圖1　兩組原代、第2代軟骨終板細胞比較

3　討　論

椎間盤源性腰痛多為椎間盤退行性改變，進而刺激椎間盤軟骨終板、髓核及纖維環等組織，引起椎間盤內痛覺感受器變化進而產生，用藥宜從氣血入手，兼之補腎，以此治療各種椎間盤源性腰痛［5］。椎間盤可分為髓核、纖維環和軟骨終板，每種組織均含有豐富的細胞外基質和不同形態的細胞，其自身無血管分布，營養主要通過滲透作用送達［6-7］。軟骨終板是椎間盤主要的營養滲透介質，同時也是維持脊柱生物力學的重要組成部分，因此椎間盤的病變過程往往伴有軟骨終板的異常變化。通過實驗研究生長因子注射、轉基因干預、細胞移植等方法促進基質再生從而修復受損的椎間盤已成為脊柱基礎研究領域的熱點［8］，針對中藥及相關成分干預軟骨終板進而治療椎間盤源性腰痛的研究也日益增多［9-10］。軟骨終板作為椎間盤組織中的重要組成部分，建立穩定的軟骨終板細胞培養體系，有助于系統的研究各種手段干預脊柱疾病的機理。本研究在實驗中成功的應用胰蛋白酶與Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶聯合消化分離培養軟骨終板細胞，并發現原代軟骨終板細胞在培養48 h后仍未完全貼壁，因此軟骨終板細胞的實驗室培養，其貼壁的時間較其他種類細胞時間長，實驗過程中應盡量避免早期的移動培養容器，防止細胞不貼壁，這將為今后同類的研究工作提供借鑒。

軟骨終板的生物化學成分主要包括蛋白多糖、膠原和水。蛋白多糖是維持椎間盤正常結構、代謝和生物力學性能的生化基礎；膠原纖維平行于椎體的上下面排列，纖維上附著蛋白多糖分子，纖維相互間的交叉構成有通透性的彈力網；水分是軟骨終板的重要組成成分，其含量的變化與蛋白多糖的含量密切相關［11］。蛋白聚糖和Ⅱ型膠原同為椎間盤細胞外基質表達的特征性產物，目前認為上調蛋白聚糖、Ⅱ型膠原基因表達能有效減少軟骨終板細胞凋亡，進而達到減輕椎間盤損傷的病理發展的目的［12］。在同一組織中，常同時存在幾種類型的膠原，但常有一種類型占優勢，而軟骨周圍基質中則主要為Ⅱ型膠原。膠原酶有多種同工酶，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型及肝細胞專用酶，Ⅰ、Ⅱ型膠原酶屬同工酶，均可消化各型膠原，但軟骨終板周圍基質中主要為Ⅱ型膠原，因此Ⅱ型膠原酶在軟骨終板細胞培養中具有潛在優勢。本研究通過細胞計數和細胞增殖測定等實驗方法，研究發現Ⅱ型膠原酶在相同條件下較Ⅰ型膠原酶能獲得更多的軟骨終板細胞，但兩者在酶消化獲得細胞的增殖活性上不存在顯著差異，以此供研究者合理設計實驗方案提供參考。

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中圖分類號：R274

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0397-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.007

*基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（Y2110928）

通信作者△（電子郵箱：tangxk＠yeah.net）

收稿日期（2015-11-13）

Comparison Study of Two Different Type of Collagenases′Digestion Efficiency on Cartilage Endplates Culture

TANG Xiaokang，LI Min，YING Hang，et al.
The First Affiliated Hospital of Hunan Chinese Medicine University，Hunan，changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To evaluate the different efficiency of cartilage endplates obtained by Type-Ⅰcollagenase digestion and Type-Ⅱcollagenase digestion.Methods：The New Zealand White Rabbits were used for cartilage endplates tissue obtained.The tissue fragments were equally divided into 2parts，and marked as group of Type-Ⅰcollagenase and group of Type-Ⅱcollagenase.Both of them were digested by trypsin for15 minutes.Then they were digested by typeⅠcollagenase and typeⅡcollagenase separately for three times，each time lasting about1hours.The cells suspension got from the three-time digestions mixed the cells were cultured.The cells in 2groups were respectively counted.Their shapes were observed and their proliferation were assayed.The differences between the two groups of cell counted，shapes and proliferation were compared.Results：The results of cell counting showed that the cell number of Type-Ⅰcollagenase group was smaller than Type-Ⅱcollagenase.Both of cells had polygon shapes.Type-Ⅰcollagenase group′s OD was（0.561±0.003），and Type-Ⅱcollagenase group′s OD was（0.562±0.002）.There was no statistical difference in optical density between them（P > 0.05）.Conclusion：The efficiency of cartilage endplates obtained in typeⅡgroup is higher Type-Ⅰcollagenase.

【Key words】Cartilage endplates；TypeⅠcollagenase；TypeⅡcollagenase；Cell culture