黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學習記憶及腦組織PS-1蛋白表達的影響*

王　威　劉文博　唐　偉　遲海濤（.大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧大連6000；.大連大學附屬新華醫(yī)院，遼寧大連6000）

?

黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學習記憶及腦組織PS-1蛋白表達的影響*

王威1劉文博1唐偉2△遲海濤2
（1.大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116000；2.大連大學附屬新華醫(yī)院，遼寧大連116000）

【摘要】目的通過觀察黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學習記憶及腦組織早老素-1（PS-1）蛋白表達的影響，以評價黃精的抗衰老作用及其機制。方法雄性SD大鼠24只，隨機分為假手術組、模型組、黃精多糖組、尼莫地平組，每組6只。采用二血管閉塞（2VO）建立慢性腦缺血大鼠模型，給予0.9%氯化鈉注射液、黃精多糖、尼莫地平灌胃8周。Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力；尼氏染色檢測海馬神經(jīng)元損傷；免疫組織化學法測定前額皮質和海馬區(qū)PS-1蛋白表達。結果1）Morris水迷宮實驗：黃精多糖組較模型組平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿臺次數(shù)增多（P＜0.05），黃精多糖組和尼莫地平組之間無顯著差異（P＞0.05）。2）尼氏染色檢測：模型組前額皮質和海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)尼氏體陽性神經(jīng)元明顯減少，染色較淺，黃精多糖組較模型組尼氏體陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，與尼莫地平組比較無顯著性差異（P＞0.05）。3）免疫組化檢測：黃精多糖組較模型組大鼠前額皮層、海馬區(qū)PS-1的蛋白表達減少（P＜0.05），黃精多糖組與尼莫地平組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結論黃精多糖能改善慢性腦缺血大鼠的一般行為學評價及組織學變化，減輕細胞結構紊亂，降低慢性腦缺血大鼠前額皮質和海馬區(qū)PS-1的蛋白表達。

【關鍵詞】慢性腦缺血學習記憶黃精多糖PS-1蛋白

黃精多糖是黃精根莖提取的具有多種生物活性的植物多糖，有研究表明黃精多糖可顯著改善阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠的記憶功能，減輕突觸變性，增加突觸數(shù)量［1］。近年來基礎和臨床研究均表明慢性腦缺血與AD發(fā)病密切相關的，而β-淀粉樣蛋白（Aβ）過多聚集是AD主要病理特征［2］。早老素-1（PS-1）基因作為產(chǎn)生Aβ的關鍵復合酶γ分泌酶的核心成分，其突變被認為與70%～85%的家族性AD發(fā)病有關［3］。本研究探討黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學習記憶及腦組織PS-1蛋白表達的影響，闡述黃精抗衰老作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1試劑黃精多糖由中國藥科大學藥理研究室提供（每1 mL相當于黃精生藥10g），急性毒理試驗黃精多糖對大鼠灌胃給藥的LD50為75 mL/kg（相當于含生藥750mg/kg），治療劑量無毒副不良反應。尼莫地平由拜爾公司提供（批號20140607）。

1.2分組與造模雄性SD大鼠24只，體質量400～450g，SPF級，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，每組6只。采用二血管閉塞法（2VO）建立慢性腦缺血大鼠模型，大鼠以水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉固定在鼠板上，頸正中縱行切開皮膚，找到雙側頸總動脈，絲線行永久性結扎，縫合皮膚。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外其他處理同模型組。

1.3給藥方法假手術組、模型組灌胃0.5mL 0.9%氯化鈉注射液；黃精多糖組將黃精多糖2mL/（kg·d）溶于0.5 mL 0.9%氯化鈉注射液后灌胃；尼莫地平組按10mg/kg（每200mg尼莫地平溶于100mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，配制成0.2%懸濁液）灌胃。造模術后24 h開始灌胃給藥，每日1次，每8周時進行行為學測試。

1.4神經(jīng)行為學測定Morris水迷宮實驗進行神經(jīng)行為學測定，水迷宮實驗分兩個階段，分別為定位航行實驗和空間探索實驗。1）定位航行實驗：檢測大鼠的學習能力，分析逃避潛伏期。2）空間探索實驗：檢測大鼠的記憶能力，觀察60s內(nèi)大鼠的運動軌跡和穿越原有平臺位置的次數(shù)。

1.5標本采集及檢測神經(jīng)行為學測定后，各組小鼠用4%水合氯醛以10mL/kg的劑量腹腔注射麻醉后開胸，充分暴露心臟4%多聚甲醛灌流，直至大鼠四肢及尾部僵硬為灌流固定充分，取出腦組織放置于4%多聚甲醛中固定。

1.5.1尼氏染色檢測前額皮質和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞損傷常規(guī)石蠟包埋，切片厚約5 μm，直接貼于載玻片上。在焦油固紫工作液中染色15～30min，蒸餾水洗去浮色后，乙醇中脫色（共約10s左右），鏡下觀察到清晰的藍紫色尼氏顆粒即可。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5.2免疫組化法檢測前額皮質和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每片厚約5 μm行免疫組織化學染色。切片常規(guī)石蠟脫水，滅活內(nèi)源性酶，熱修復。滴加5%BSA封閉液。滴加稀釋的一抗（PS-1按1∶75稀釋），4℃過夜，二抗孵育，37℃20min（二抗為生物素標記的羊抗兔IgG），滴加試劑SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

1.6統(tǒng)計學處理Leiea圖像采集系統(tǒng)顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測定陽性細胞數(shù)：每組每只大鼠雙側大腦皮層、海馬CA1區(qū)各5個高倍視野（10×10）視野下免疫組化、尼氏體陽性細胞密度（個/mm2）。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。多樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組神經(jīng)行為學檢測結果見表1。通過連續(xù)的訓練，黃精多糖組、尼莫地平組較模型組平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿臺次數(shù)增多（P＜0.05）。黃精多糖組、藥物對照組兩組間平均逃避潛伏期、穿臺次數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

表1　各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

表1　各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同。

組　別　n　平均逃避潛伏期（s）　穿臺次數(shù)（次/60s）假手術組6.　18.34±6.18*　7.13±2.6*模型組6.　34.23±10.78　3.74±0.79黃精多糖組6.　19.55±4.03*　6.41±2.00*尼莫地平組6.　20.76±6.96*　6.87±2.46*

2.2前額皮質和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色結果見表2。圖像分析顯示，前額皮質和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色模型組染色較淺，有明顯的神經(jīng)元丟失，細胞形態(tài)破壞，排列紊亂。黃精多糖組尼氏染色陽性細胞數(shù)均較模型組顯著增加，而黃精多糖組、尼莫地平組兩組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2　各組前額皮質和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽性細胞數(shù)比較（±s）

表2　各組前額皮質和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽性細胞數(shù)比較（±s）

組別　n　前額皮質　海馬CA1區(qū)假手術組6.　32.96±106.74*　42.54±13.68*模型組6.　15.98±6.87　12.88±5.47黃精多糖組6.　28.89±10.34*　37.54±10.78*尼莫地平組6.　34.34±304.78*　29.37±7.70*

2.3前額皮質和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達見表3。免疫組化前額皮質和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白陽性細胞著色部位在胞漿，細胞突起和神經(jīng)纖維著色，PS-1蛋白表達陽性細胞數(shù)黃精多糖組較模型組明顯減少（P＜0.05），而黃精多糖組、尼莫地平組間無顯著差異（P＞0.05）。

表3　各組前額皮質和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達陽性細胞數(shù)比較（±s）

表3　各組前額皮質和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達陽性細胞數(shù)比較（±s）

組別　n　前額皮質　海馬CA1區(qū)假手術組6.　16.46±4.91*　17.97±7.84*模型組6.　44.98±12.36　45.17±13.46黃精多糖組6.　16.31±6.99*　18.57±7.64*尼莫地平組6.　17.88±9.11*　16.43±7.20*

3　討　論

有研究表明黃精多糖具有良好的降血糖［4］、調(diào)血脂［5］、抗炎［6］作用。對老齡大鼠具有提高學習、記憶能力［7］。黃精多糖還可以減少腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡［8］，而對慢性腦缺血研究較少。本實驗Morris水迷宮定位航行試驗中，黃精多糖組、尼莫地平組較模型組平均逃避潛伏期延長，穿臺次數(shù)增多。黃精多糖組、尼莫地平組組間平均逃避潛伏期、穿臺次數(shù)無顯著差異，表明慢性腦缺血可引起動物的學習記憶障礙，黃精多糖組可明顯改善模型大鼠的學習記憶能力。

皮層和海馬神經(jīng)元變性是慢性腦缺血的組織學改變之一。本研究顯示大鼠雙側頸總動脈結扎2個月后，模型組光鏡觀察發(fā)現(xiàn)海馬CAl區(qū)神經(jīng)元大量變性、死亡，數(shù)目減少，海馬組織結構紊亂，錐體細胞形態(tài)異常。黃精多糖組皮層、海馬CA1區(qū)尼氏染色陽性細胞數(shù)均較模型組顯著增加，說明黃精多糖可減少尼氏體的丟失，減輕海馬神經(jīng)元的損傷和破壞，從而改善學習記憶能力。

近年來研究表明慢性腦缺血所致癡呆與Aβ的神經(jīng)毒性作用關系密切，慢性腦缺血模型大鼠有認知功能障礙，并在老年斑和神經(jīng)元纖維纏結中發(fā)現(xiàn)了大量Aβ，說明了Aβ和慢性腦缺血密切相關［9］。PS-1是產(chǎn)生Aβ生成的關鍵復合酶γ分泌酶的核心成分，是酶復合物的活性中心，它首先被一種未知的水解酶切割為相對分子質量為18 kd的羧基片段（CTF）和28 k氨基片段（NTF），再與其他蛋白質一起形成Y分泌酶多聚體，其表達的水平不同導致了Aβ生成的差異［10］。免疫組化PS-1蛋白表達陽性著色部位在胞漿，細胞突起和神經(jīng)纖維著色，假手術組顯示皮層、海馬CA1區(qū)有少量PS-1表達，模型組皮層、海馬CA1區(qū)PS-1表達增加，與假手術組相比，陽性細胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）。黃精多糖組皮層、海馬CA1區(qū)PS-1表達陽性細胞數(shù)均較模型組顯著減少，說明黃精多糖可抑制慢性腦缺血致PS-1異常升高。

本研究結果表明黃精多糖可改善慢性腦缺血大鼠學習記憶，減輕神經(jīng)元損傷，同時抑制了PS-1的表達上調(diào)，已知PS-1作為γ分泌酶核心成分是產(chǎn)生Aβ的關鍵環(huán)節(jié)，因此推測黃精多糖可能是通過抑制PS-1而降低了Aβ的生成，提示黃精多糖可能在AD防治中有一定作用。

參考文獻

［1］成威，李友元，鄧洪波.黃精多糖對阿爾茨海默病小鼠海馬CA1區(qū)突觸界面的影響［J］.臨床與病理雜志，2014，34（4）：400-401

［2］唐偉.阿爾茨海默病發(fā)病機制研究進展［J］.醫(yī)學與哲學，2014，35（1B）：49-51.

［3］徐恒衛(wèi)，孫井，杜冠華.AD治療新藥物γ分泌酶抑制劑［J］.中國藥理學通報，2003，19（9）：982-987.

［4］紅玲，張渝洪，洪艷，等.黃精多糖對小鼠血糖的水平的影響及機制初探［J］.兒科藥學雜志，2002，8（1）：14-15.

［5］吳焱榮，李友元，肖灑，等.黃精多糖調(diào)脂作用的實驗研究［J］.中國新藥雜志，2003，12（2）：108-110.

［6］鄭春艷，汪好芬.黃精多糖的抑菌和抗炎作用研究［J］.安徽師范大學學報：自然科學版，2010，33（3）：272-275.

［7］黃芳，蒙義文.黃精多糖對老齡大鼠學習記憶能力的影響［J］.應用與環(huán)境生物學報，1999，5（1）126-128.

［8］葉云，鄧洪波.李友元黃精多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.醫(yī)學臨床研究，2006，23（3）：292-293.

［9］陳生弟，鄧鈺蕾.阿爾茨海默病診治中的若干熱點及挑戰(zhàn)［J］.老年醫(yī)學與保健，2012，18（2）：65-67.

［10］Roberson ED，Mucke L.100Years and counting：prospects for defeating Alzheimer′s disease［J］.Science，2006，314：781-784.

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0408-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.011

*基金項目：遼寧省博士啟動基金項目（20111124）

通信作者△（電子郵箱：1191447970＠qq.com）【Abstract】Objective：To evaluate the anti-aging effect of polygona-polysaccharose and its mechanism by observing the effects of Polygona-polysaccharose on learning and memory and PS-1 protein expression of rats with chronic cerebral hypoperfusion.Methods：24 male SD rats were randomly divided into 4 groups：sham operated group，the model group，Polygona-polysaccharose group，the control group，6rats in each.2VO was adopted to establish the rat model of chronic cerebral hypoperfusion，given lavage of 0.9%sodium chloride injection，Polygonapolysaccharose and nimodipine for 8 weeks.The ability of learning and memory was measured with Morris water maze test；hippocampal neuronal damage was detected with the method of Nylon staining；the expression of PS-1 in prefrontal cortex and hippocampus was determined by immunohistochemistry.Results：1）The experimental result of Morris water maze showed that compared with the model group，average escape latency of polygona -polysaccharose group was shortened（P＜0.05），and the times of drill increased（P＜0.05）.There was no significant difference between polygona-polysaccharose group and the control group（P＞0.05）.2）Nylon staining showed that in the model group，the positive neurons significantly decreased and the staining was light in prefrontal cortex and hippocampal neurons，while the polygona-polysaccharose group was opposite，and compared with the control group，there was no significant difference（P＞0.05）.3）Immunohistochemical detection showed that compared with the model group，PS-1 protein expression in prefrontal cortex and hippocampus of rat reduced in polygonapolysaccharose group（P＜0.05）.There was no significant difference between polygona-polysaccharose group and the control group（P＞0.05）.Conclusion：Polygona-polysaccharose can improve the general behavioral assessment and histological changes，decrease cell structure disorder，and reduce PS-1 protein expression in prefrontalcortex and hippocampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion.

收稿日期（2015-10-27）

The Effects of Polygona-polysaccharose on Learning and Memory and PS-1 Protein Expression of Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion

WANG Wei，LIU Wenbo，TANG Wei，et al.
Zhongshan Hospital Af-filiated to Dalian University，Liaoning，Dalian116000，China.

【Key words】Chronic cerebral hypoperfusion；Learning and memory；Polygona-polysaccharose；PS-1 protein