益氣活血方的急性毒性作用及對(duì)大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)SOD、MDA含量的影響*

楊　宇　夏建龍△　陳　剛　楊　挺　蔡　平（.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京003；.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京0046）

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益氣活血方的急性毒性作用及對(duì)大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)SOD、MDA含量的影響*

楊宇1夏建龍1△陳剛2楊挺1蔡平2
（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210046）

【摘要】目的觀察益氣活血方的急性毒性試驗(yàn)以及對(duì)大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影響。方法1）20只ICR小鼠隨機(jī)選取5只為假手術(shù)組，余15只為實(shí)驗(yàn)組，采用最大給藥量的方法觀察益氣活血方的急性毒性反應(yīng)。2）60只SD大鼠，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，僅暴露椎板，未造成脊髓壓迫，以生理鹽水進(jìn)行灌胃；其余的SD大鼠采用自體第7頸椎棘突椎間移植法制造大鼠脊髓壓迫模型。術(shù)后1 d根據(jù)脊髓功能的評(píng)分將其分為益氣活血方組：造模后，以不同濃度的益氣活血方進(jìn)行灌胃。頸復(fù)康組：造模后，以頸復(fù)康進(jìn)行灌胃。模型對(duì)照組：造模后，以生理鹽水進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃4周后，采用ELISA方法測定大鼠受損節(jié)段中SOD和MDA的含量。結(jié)果小鼠的最大給藥量相當(dāng)于生藥的892.5 g/（kg·d），為臨床成人日用量的315倍，在此劑量下未見明顯毒性反應(yīng)，7 d內(nèi)無1例動(dòng)物死亡；不同濃度的益氣活血方及頸復(fù)康顆粒均能顯著增加大鼠受損脊髓組織內(nèi)SOD的含量（P＜0.05）；中藥高、中濃度以及頸復(fù)康顆粒均能顯著降低MDA的含量（P＜0.05），中藥低濃度也降低MDA的含量，但是與模型對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論益氣活血方是安全的且能有效提高受損脊髓組織細(xì)胞中氧自由基的清除率，促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】益氣活血方大鼠小鼠急性毒性試驗(yàn)脊髓型頸椎病SOD MDA

脊髓型頸椎病是由于頸椎間盤退變及突出、椎體后緣及鉤椎關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生、后縱韌帶骨化、黃韌帶肥厚或鈣化，導(dǎo)致脊髓受壓、缺血，繼而出現(xiàn)脊髓功能障礙的疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為頸項(xiàng)部疼痛、上肢酸脹、疼痛、麻木、無力感，嚴(yán)重者可出現(xiàn)上肢肌力下降，握拳困難，手指精細(xì)動(dòng)作減弱，行走不穩(wěn)、易摔跤以及肢體觸痛覺減退或過敏，胸腹部束帶感。本病好發(fā)于中老年人，發(fā)病率為10%～15%，男性多發(fā)，本病常因天氣變化、寒冷刺激、勞累等原因誘發(fā)。目前中藥治療脊髓型頸椎病的臨床研究很多，但是從炎癥及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制來探討防治脊髓型頸椎病的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。本研究應(yīng)用最大給藥量法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)研究及采用大鼠自體第7頸椎棘突椎間移植法制作大鼠脊髓壓迫模型，來觀察益氣活血方服用的安全性以及能否通過抑制氧自由基的表達(dá)和促進(jìn)超氧化物歧化酶（SOD）的產(chǎn)生，達(dá)到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的目的，以期為益氣活血方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組ICR鼠，雌雄兼?zhèn)洌?0只，體質(zhì)量（20±2）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究室提供，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SYCK（蘇）2012-0004。SD大鼠，雌雄兼?zhèn)洌?0只，體質(zhì)量（200±2）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2試藥與儀器藥材黃芪、陳皮、甘草、桂枝、羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸、蜈蚣、延胡索、地龍、獨(dú)活、澤蘭、葛根及生理鹽水、酒精、碘伏、青霉素均購置于江蘇省中醫(yī)院。純水，10%水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140115），頸復(fù)康（頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：490283），SOD和丙二醛（MDA）試劑盒購置于南京建成生物研究所并由其研究所代測。刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、萬分之一天平、直鉗、剃毛機(jī)等均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究室提供，1 mL注射器、針、線、23號(hào)刀片、醫(yī)用紗布、棉球均購置于江蘇省中醫(yī)院。

1.3藥物制備小鼠實(shí)驗(yàn)取中藥材于江蘇省中醫(yī)院代煎，將代煎好的中藥按成人臨床用藥量的315倍濃縮至生藥8.5 g/mL。大鼠實(shí)驗(yàn)取中藥材于江蘇省中醫(yī)院代煎，將代煎好的中藥按成人臨床用藥量的20倍換算為高濃度、10倍換算為中濃度、5倍換算為低濃度，中藥高濃度濃縮至生藥5.4 g/mL、中藥中濃度將高濃度用純水等倍稀釋至生藥2.7 g/mL、中藥低濃度將中濃度用純水等倍稀釋至生藥1.35 g/mL。用研缽將頸復(fù)康磨細(xì)之后，用純水配制成0.17 g/mL；用萬分之一天平稱取10g水合氯醛，用100mL純水配制成10%水合氯醛備用。

1.4藥物毒性實(shí)驗(yàn)采用最大給藥量法［1］進(jìn)行試驗(yàn)，ICR小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，益氣活血方組15只，對(duì)照組5只，禁食12h，期間正常飲水，24 h內(nèi)以最大生藥質(zhì)量濃度8.5 g/mL，小鼠灌胃所能承受的最大體積（35 mL/kg）灌胃給藥3次，每6小時(shí)給藥1次，每日3次，時(shí)間分別為10∶00、16∶00、22∶00，對(duì)照組灌胃等量（35 mL/kg）生理鹽水，最后1次給藥后結(jié)束禁食。

1.5脊髓壓迫實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓壓迫模型的構(gòu)建參考徐遠(yuǎn)坤等［2］的方法，SD大鼠隨機(jī)選取10只為假手術(shù)組（只暴露頸椎椎板，不咬除椎板，不造成大鼠脊髓壓迫模型），其余50只均在10%水合氯醛（0.4 mL/kg）麻醉下，用剃毛機(jī)剃除大鼠頸后部的毛，常規(guī)碘伏消毒，鋪巾，取大鼠頸椎后正中切口長3～4 cm，切開皮膚、皮下，暴露頸肩部肌群，找到第7頸椎棘突（所有頸椎棘突均可用手觸及，最高突起處即是），自下往上正中切開肌肉群向兩側(cè)牽開，沿棘突兩側(cè)以23號(hào)刀片剝離棘突上附著肌肉，即可暴露整個(gè)頸椎骨面；自第7頸椎棘突基底部離斷第7頸椎棘突并取出，刮除骨面附著組織備用；自第7頸椎棘突往上找到第5或6頸椎椎板，咬除部分椎板，并取相應(yīng)直徑的第7頸椎棘突骨塊植入椎間隙，以不出現(xiàn)松動(dòng)為度，并盡量向椎管內(nèi)嵌壓，以出現(xiàn)上肢肌肉反射性抽搐為度，縫合肌肉、皮膚，肌肉注射青霉素8萬U/只，術(shù)畢。青霉素連續(xù)肌肉注射3 d，術(shù)前及術(shù)后均不必禁食。為了避免動(dòng)物相互擠壓造成的傷害甚至死亡，術(shù)后采取單籠喂養(yǎng)并任其自由活動(dòng)，造模過程中由于麻醉劑量控制不精準(zhǔn)導(dǎo)致術(shù)中大鼠死亡7只，3只可能是因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷太大從而導(dǎo)致全身衰竭而亡。取材，取出受損組織后放進(jìn)液氮中，后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存，用時(shí)取出用于檢測SOD、MDA的含量。為保證大鼠受損脊髓由急性壓迫轉(zhuǎn)為慢性壓迫，術(shù)后適應(yīng)性觀察2周，待大鼠傷口基本愈合后采取合籠喂養(yǎng)，為保證脊髓損傷輕與重的大鼠在每組中的數(shù)量相當(dāng)，術(shù)后1 d根據(jù)改進(jìn)Rivaling的斜板實(shí)驗(yàn)的平均度數(shù)、Tarlov評(píng)分、BBB評(píng)分將其分為益氣活血方高濃度組［54 g/（kg·d）］、益氣活血方中濃度組［27 g/（kg·d）］、益氣活血方低濃度組［13.5 g/（kg·d）］組、頸復(fù)康組（1.7 g/kg）、模型對(duì)照組。益氣活血方高、中、低濃度組以及頸復(fù)康組采用1 mL/100g灌胃給藥，模型對(duì)照組及假手術(shù)組灌服等量（1 mL/100g）0.9%氯化鈉溶液，每日給藥1次，連續(xù)4周。

1.6檢測指標(biāo)觀察給藥后小鼠的外表、行為、反射活動(dòng)、飲水量、大小便及存活情況等，詳細(xì)觀察并記錄給藥后4 h內(nèi)小鼠的反應(yīng)情況，然后每天觀察1次，連續(xù)觀察7 d。記錄所有小鼠的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、是否可逆等。觀察期結(jié)束，處死所有動(dòng)物，并將全部存活小鼠進(jìn)行大體解剖，當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織器官出現(xiàn)體積、質(zhì)地、顏色等改變時(shí)，對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和兩兩比較的LSD和Tamhane’T2（M）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1益氣活血方對(duì)小鼠急性毒性的影響見表1。益氣活血方的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠日最大給藥量為892.5 g/kg，益氣活血方組小鼠在灌胃給藥后除了出現(xiàn)排褐色稀便的情況外，并無其他明顯中毒癥狀，且褐色稀便與益氣活血方中使用大量的活血化瘀、利水消腫藥物有關(guān)，排褐色稀便的癥狀均在用藥后1～2d內(nèi)消失。觀察7 d后各組小鼠均存活，無1例死亡，試驗(yàn)結(jié)束后處死所有小鼠并用肉眼觀察小鼠大體解剖，未發(fā)現(xiàn)組織臟器出現(xiàn)體積、質(zhì)地、顏色等改變。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［3］中急性毒性實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，益氣活血方在本實(shí)驗(yàn)條件下，采用最大給藥量法（892.5 g/kg）并連續(xù)觀察7 d，小鼠未出現(xiàn)毒性癥狀，無小鼠死亡，LD50＞892.5 g/kg，表明益氣活血方是安全的。

表1　益氣活血方對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)

2.2益氣活血方對(duì)大鼠受損脊髓組織內(nèi)氧自由基的影響見表2。與模型對(duì)照組相比，不同濃度的益氣活血方及頸復(fù)康顆粒均能顯著增加大鼠受損脊髓組織內(nèi)SOD的含量（P＜0.05），中藥高、中濃度以及頸復(fù)康顆粒均能顯著降低MDA的含量（P＜0.05），中藥低濃度亦能降低其MDA的含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)果表明益氣活血方具有促進(jìn)氧自由基清除的功能。

表2　各組大鼠脊髓組織中SOD、MDA含量比較（±s）

表2　各組大鼠脊髓組織中SOD、MDA含量比較（±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別　n　SOD（ng/mL）　MDA（nmol/mL）中藥低濃度組　8　10.85±0.33*　8.47±0.21中藥中濃度組　9　10.97±0.67**　8.32±0.20*中藥高濃度組　9　11.26±1.24**　7.94±0.68***頸復(fù)康組　9　10.87±0.63*　8.07±0.38**模型對(duì)照組　8　9.93±0.50　8.70±0.32假手術(shù)組　7　13.31±0.84***　7.47±0.33***

3　討　論

脊髓型頸椎病屬中醫(yī)學(xué)中的“痹”“痿”等證范疇。《醫(yī)林改錯(cuò)》指出“痹久有瘀血”，即瘀血也是痹癥的重要因素。本病為本虛標(biāo)實(shí)，氣血不足，瘀血內(nèi)阻，髓失所養(yǎng)之證。勞則耗氣，久勞其氣必虛，“氣為血之帥”“氣行則血行”，氣虛導(dǎo)致血瘀，血瘀導(dǎo)致不通則痛；氣能生血，氣虛則血亦虛，肌膚、筋骨、脊髓失于濡養(yǎng)則可出現(xiàn)肢體麻木、肌肉萎軟無力、行走不穩(wěn)等癥狀；脾失健運(yùn)，水濕不化，濕著于內(nèi)則衛(wèi)氣不榮，肌肉頑痹；此外，氣血失和，筋脈失養(yǎng)，腠理空虛，風(fēng)寒濕邪乘虛而入，合而為痹。研究表明，脊髓受壓后缺血與缺氧導(dǎo)致某些內(nèi)源性物質(zhì)的激活，導(dǎo)致局部自由基蓄積，使脊髓血管痙攣、閉塞，血流量進(jìn)一步減少、水腫加劇，引起脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能損傷甚至變性壞死。在脊髓受壓繼發(fā)性損害的過程中，機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物。SOD能夠直接清除氧自由基，避免活性氧的傷害。故組織中SOD含量的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［3］。二者聯(lián)合測定能間接反映氧自由基的含量及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)度［4］，SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，通過自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱苷肽過氧化氫酶變?yōu)樗?，是清除自由基的機(jī)制之一［5］。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論“氣行則血行，治血先治氣”的觀點(diǎn)，導(dǎo)師夏建龍創(chuàng)立了益氣活血方，其以圣愈湯為主方，原方出自《脈因證治·金瘡》卷4，為著名醫(yī)家朱震亨所創(chuàng)。導(dǎo)師夏建龍?jiān)谂R床中以該方為基本方，隨癥加減，靈活運(yùn)用，用于治療脊髓型頸椎病以及改善脊髓型頸椎病術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)，其組成為黃芪、陳皮、甘草、桂枝、羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸、蜈蚣、延胡索、地龍、獨(dú)活、澤蘭、葛根14味中藥，方中重用黃芪、當(dāng)歸、丹參為君藥，取其補(bǔ)益氣血、活血化瘀之功，延胡索、地龍、蜈蚣、桂枝活血化瘀通絡(luò)，羌活、獨(dú)活祛風(fēng)勝濕止痛，陳皮、茯苓、澤蘭燥濕利水，葛根生津舒筋，甘草調(diào)和諸藥，諸藥共奏益氣活血，利水消腫，通絡(luò)止痛之功，對(duì)治療該病具有很好的療效，且服用安全、方便。藥理實(shí)驗(yàn)顯示黃芪提取物（黃芪甲苷）具有非常好的抗氧化作用［6］，在體內(nèi)缺血再灌注損傷［7］模型中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)黃芪甲苷灌胃后的動(dòng)物體內(nèi)SOD等抗氧化酶的含量增加，Bcl-2基因表達(dá)增加，而Bax基因表達(dá)下降，抑制超氧離子的產(chǎn)生，減輕由超氧離子引起的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)損傷，以及組織損傷和壞死。當(dāng)歸在保護(hù)損傷神經(jīng)及促進(jìn)神經(jīng)再生方面具有重要作用［8］，同時(shí)，當(dāng)歸還具有抗輻射、抗氧化、抗衰老的作用［9］。丹參提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為一種新的自由基清除劑和天然抗氧化劑［10］，丹參通過對(duì)超陰離子的清除作用來阻止生物膜的脂質(zhì)過氧化，保護(hù)生物膜的作用［11］。黃芪、丹參、當(dāng)歸等能直接擴(kuò)張周圍血管，明顯改善微循環(huán)［12］；能減輕神經(jīng)水腫、炎癥、出血、變性和脫髓鞘，來促進(jìn)神經(jīng)的再生［13］，方中諸藥合用，有明顯的增強(qiáng)氧自由基清除率以及改善脊髓型頸椎病術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)的作用。

方中含有地龍、蜈蚣有毒之品，劑量雖小，但仍恐其損傷人體，所以對(duì)其進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用最大給藥量法對(duì)益氣活血方進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)研究以及采用大鼠自體第7頸椎棘突椎間移植法制造脊髓壓迫模型來觀察不同濃度的益氣活血方對(duì)受損脊髓內(nèi)SOD和MDA含量的影響，通過該研究可以證明，益氣活血方是安全的，且具有提高氧自由基清除率的功能，其機(jī)制可能與方中活血藥有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）03-0414-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.013

*基金項(xiàng)目：江蘇省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（LZ13012）

通信作者△（電子郵箱：drjlxia＠aliyun.con）

收稿日期（2015-11-15）

The Acute Toxicity Test and Effects of Yiqi Huoxue Decoction on the Contents of SOD and MDA in Dam-aged Rats′Spinal Cord Tissue of the Chronic Spinal Oppression Model

YANG Yu，XIA Jianlong，CHEN Gang，et al.
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China.

【Abstract】Objective：To study the acute toxicity test and the potential effects exerted on the contents of SOD and MDA in damaged rats′spinal cord tissue of the Yiqi Huoxue Decoction.Methods：1）20ICR mice were randomly selected，5 for the control group，the rest for the experimental group，and then the method of maximum dosage was adopted to observe the acute toxicity response of PNQAB.2）10SD-Rats were chosen as the shamoperated group randomly from the sixty subjects，fed with the normal saline within explosion of the vertebral lamina and freed from oppression of the spinal cord；the remaining were applied to establish the rat′s spinal oppression model by grafting the self 7th cervical vertebrae spinous process at the part of C4-5 or C5-6intervertebral space，then divided into three groups based on the assessment results of the spinal cord function at the1st day postoperatively，fed with the Yiqi Huoxue Decoction under different concentrations（Group A），Jinfukang（Group B）and Normal saline（Group C），respectively.After treating 4 weeks，all the rats were narcotized to get the specific spinal cord for the determinations of SOD and MDA.Results：The daily maximum dosage equal to crude drugs to mice was 892.5 g/kg，315 times of daily clinical dosage of adult.Within the dose，obvious toxic effects was not seen，ang no animals died within 7 days.The results showed that the Yiqi Huoxue Decoction regardless of the concentration difference and Jingfukang Particles could both increase the content of SOD in rats′damaged spinal cord tissues significantly（P＜0.05）；while the Yiqi Huoxue Decoction within high/medium concentrations and Jingfukang particles could also notably decrease MDA content，but not for the Yiqi Huoxue Decoction in low concen-tration.Conclusions：The Yiqi Huoxue Decoction is safe and can effectively enhance the scavenging rate of the reactive oxygen radicals in tissues of the damaged spinal cord，and promotes the recovery of the spinal cord function.

【Key words】Yiqi Huoxue Decoction；Rat；Mice；Acute toxicity test；CSM；SOD；MDA