篩選人睪丸特異性含溴結構域蛋白(BRDT)的小分子抑制劑

高娜娜，侯麗，周越，辛玲，楊朵，李娜，王慧萍*

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京　100038；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京　100081)

·技術與方法·

篩選人睪丸特異性含溴結構域蛋白(BRDT)的小分子抑制劑

高娜娜1，2，侯麗2，周越2，辛玲2，楊朵1，李娜1，王慧萍2*

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京100081)

【摘要】目的睪丸特異性含溴結構域的蛋白(BRDT)在睪丸中特異表達，參與精子生成的染色質重組過程。本文虛擬篩選基于結構的人BRDT小分子抑制劑。方法從PDB(Protein Data Bank)下載BRDT核心結構域與小分子抑制劑JQ1結合結構域的晶體結構(PDB ID：4FLP)，利用分子模擬軟件Discovery Studio 3.0，構建了其活性位點抑制劑的藥效團模型。運用最佳藥效團模型對10 000個化合物的數據庫進行初篩，隨后運用Libdock分子對接方式對初篩得到的潛在目標化合物進行復篩；最后運用BRDT Bromodomain TR-FRET Assay方法，對虛擬篩選得到的化合物進行實物篩選。結果運用虛擬篩選和蛋白水平篩選相結合的方法，從40 000個化合物中最終得到1個對BRDT有較高抑制作用的小分子抑制劑T480。結論利用一種基于結構的集合虛擬篩選與蛋白水平篩選的BRDT抑制劑的高通量篩選方法，篩選到BRDT的一個小分子抑制劑。

【關鍵詞】睪丸特異性含溴結構域蛋白；男性抗生育；精子生成；虛擬篩選

Methods： The crystal structure (PDB ID：4FLP) of core domain of BRDT and binding domain of JQ1 were downloaded from PDB. In this study，the pharmacophor model of BRDT was established based on the three dimensional crystal structure of BRDT and JQ1 cocrystallization by Discovery Studio 3.0. Firstly，the optimal pharmacophore model was used to screen large compound database. Secondly，we used Libdock to screen the foregoing candidate compounds. Thirdly，We re-screened the candidate compounds using screening model at protein level. Finally，virtual screening of compounds was subjected to physical screening by BRDT Bromodomain TR-FRET Assay.

Results： Using virtual screening combined with protein level screening，a small molecular inhibitor target human BRDT (T480) was obtained from 40 000 compounds.

Conclusions： One positive compound target human BRDT is obtained through structure-based virtual screening combined with protein level screening.

(JReprodMed2016，25(6)：550-555)

男性抗生育藥物研究已經有十幾年的歷史，已經有一些激素類和非激素類抗生育藥物被發現[1-2]。這類藥物一般是通過抑制精子的生成，降低精子的數量，阻斷精子游動達到避孕的目的[3]。但目前除了進入臨床研究的藥物——睪酮類似物和gamendazole[4]之外尚無一種可以應用于臨床的口服抗生育藥物，因此開發男性抗生育藥物具有深遠的社會意義。

睪丸特異性含溴結構域的蛋白(testis-specific bromodomain-containing protein，BRDT)是bromodomain and extra-terminal(BET)BET蛋白家族的成員，它是一種包含947個氨基酸(180 kDa)的核蛋白。與BET蛋白家族其它成員最大的不同之處是，BRDT在睪丸中特異表達[5]。有報道認為，BRDT可能在腦組織和卵母細胞中有微量表達[6]，但尚未得到證實。BRDT包括兩個溴結構域：BD1(26～121)和BD2(276～364)(圖1)。有研究[7]發現，BRDT參與了睪丸中精子生成的染色質重組過程。在減數分裂之后，BRDT通過成對的乙酰基-賴氨酸識別模塊使高度乙酰化的組蛋白重組[8]，該作用是其第一溴結構域(BD1，圖1)介導的，BD1以中等效價(20 μm)[9]與組蛋白H4-4乙酰化氨基酸末端(H4Kac4)連接。通過對鼠科動物的BRDT蛋白結構研究發現，BD1通過保守的天冬氨酸殘基與二乙酰基化的組蛋白4肽段(H4K5a c8ac)結合；將BRDT1編碼區域選擇性刪除，足以使亞等位基因純合子雄性小鼠不孕[10]。對不孕不育的男性全基因組分析表明BRDT的單核苷酸多態性與歐洲男子的少精子癥和無精子癥相關[10]。此外，Jones等[11]通過mRNA檢測發現BRDT的表達只限于正常睪丸組織，并且在10例未經組織學定義的肺癌和8種不同器官的癌細胞系中也沒有檢測到BRDT，說明BRDT的表達具有非常嚴格的組織特異性。以上這些發現使BRDT成為男性抗生育藥物研究的潛在靶標。本研究應用基于人BRDT抑制劑的集合虛擬篩選方法和體外蛋白水平篩選方法，篩選BRDT的小分子抑制劑，為男性抗生育藥物研發尋找某些先導化合物。

圖1　BRDT的結構域圖解

圖2　活性化合物JQ1的對映異構體[10]

材料與方法

一、試劑

BRDT Bromodomain TR-FRET Assay試劑盒購于Cayman化學公司(美國)。

二、分子對接軟件及模塊

軟件：Discovery StudioTM3.0(accelrys公司)。分子對接模塊：DS structure-based pharmacophore modeling；Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module；DS Sequence Analysis；DS Protein Refine；DS Protein Health；DS LibDock。

三、實驗方法

1. 人BRDT小分子抑制劑藥效團模型的構建：目前PDB數據庫里已經有人BRDT與JQ1 (圖2)共結晶的三維晶體結構(PDB ID：4FLP)的報道，我們運用該結構進行藥效團模型的生成。關于BRDT小分子抑制的報道很少，我們運用的是Discovery Studio 3.0 (Accelrys，San Diego，CA，USA)的“Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module”藥效團構建模塊來構建藥效團模型。以人BRDT與JQ1共結晶活性構象的三維立體結構作為輸入文件，產生基于受體與配體結合的藥效團模型。利用Discovery Studio 3.0對BRDT活性構象立體結

構進行加氫和加水分子的處理。將最小結構特征和最大結構特征的參數分別設置為4和6。親脂性位點密度參數設為15，極性位點參數設為20。Receptor-Ligand Pharmacophore Generation模塊可以根據乙酰-賴氨酸結合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式識別活性位點中所有可能和配體相互作用的作用位點。去除那些離PTP-loop及特異性深穴較遠的作用位點，僅保留和關鍵性氨基酸殘基相互作用的作用位點，然后依據和受體的相互作用模式對所有的作用位點進行聚類，最后得到可用于虛擬篩選的藥效團模型。

2. 基于藥效團模型的虛擬篩選：把最后構建好的藥效團模型作為3D提問輸入對大型化合物數據庫進行高通量虛擬篩選，以期得到靶向BRDT活性位點的小分子抑制劑。僅保留那些匹配一半以上藥效特征元素的化合物。這些化合物再次通過Lipinski’s rule of five進行過濾，以保障其具有類藥性。

3.基于分子對接的虛擬篩選：所有的對接研究都是利用Libdock[12]進行對接的。在對接研究中，采用同樣的BRDT的活性構象的三維結構。對接中采用的是Charmm力場。對接位點定義為一個以活性位點為中心的直徑9?的球形，這個球形足以覆蓋BRDT與JQ1結合位點的關鍵氨基酸殘基。為了選取打分函數和對接參數，本研究將JQ1對接到BRDT活性位點，以對接構象是否滿足催化機制為依據進行打分函數的選擇和參數優化。

4. 體外蛋白水平篩選模型的建立及優化：該實驗的反應體系為20 μl。將陽性化合物JQ1用1×TR-FRET Assay buffer溶解至四倍的終濃度。篩選模型設置陽性對照組和陰性對照組。陽性對照組是在反應體系中加入抑制劑JQ1。陰性對照組是以1×TR-FRET Assay buffer代替樣品模擬無抑制作用。在實驗開始之前將陽性對照孔和篩選樣品孔在室溫下孵育15 min，使陽性化合物與待測樣品與BRDT bromodomainEuropium Chelate預平衡，最后加入5 μl BRDT bromodomain Ligand/APC Acceptor Mixture 引發反應。將板子用鋁箔密封在室溫孵育1 h，檢測620 nm和670 nm發射光的數值。篩選模型檢測體系如表1所示。

表1　篩選模型檢測體系

該反應體系運用TR-FRET Ratio(670 nm emission/620 nm emission)來檢測樣品與BRDT蛋白親和力。TR-FRET Ratio值越低，表明樣品與BRDT蛋白的親和力越強，反之則越弱。

結果

一、成功構建基于受體-配體藥效團模型

利用Discovery Studio 3.0中的“受體-配體藥效團模型”模塊來構建藥效團模型產生基于BRDT與JQ1復合物相互作用方式的藥效團模型。首先移除水分子，添加氫鍵形成受體結構。將最小結構特征和最大結構特征的參數分別設置為4和6。隨后Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module模塊會根據乙酰-賴氨酸結合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式識別所有可能的藥效團模型。BRDT抑制劑的最終藥效團模型(圖3)，包含5個特征元素，1個氫鍵供體特征(HBD)，4個疏水作用結構特征和14個排除體積特征。

圖4A中顯示的是該藥效團模型中起作用的氨基酸殘基有保守氨基酸殘基ASN109、ILE115、LEU61、PHE52、MET118、ASP114和藥效團結構特征。圖4B顯示的是JQ1與藥效團特征的匹配方式，從圖中可以看出JQ1與藥效團特征能夠很好的匹配。圖4C顯示的是藥效團模型同BRDT-JQ1復合晶體結構的匹配情況。從圖中可以看出氫鍵受體對應于JQ1的三唑環以及BRDT活性中心的保守氨基酸殘基Asn109之間形成的氫鍵連接，四個疏水結構特征分別與JQ1的不同部分匹配：H1、H2、H3和H4分別與JQ1的甲基，噻吩環，苯環和叔丁基相匹配。

該模型包括1個氫鍵受體(綠色表示)，4個疏水作用結構特征(藍色表示)，14個excluded volume features(排除體積特征)(灰色表示)圖3　BRDT抑制劑的最佳藥效團模型

二、基于藥效團模型的虛擬篩選

把構建好的藥效團模型作為3D提問輸入化合物數據庫(4萬個化合物)進行高通量虛擬篩選，以期得到靶向BRDT活性位點的小分子抑制劑。虛擬篩選中，僅保留那些匹配一半以上藥效團特征元素的化合物，最后得到8 937個化合物用于后續的對接研究。

三、基于分子對接的虛擬篩選

所有分子對接研究都是利用Libdock[12]進行對接的。在對接研究中，采用同樣的BRDT的活性構象的三維結構。運用Discovery studio3.0成功定義BRDT蛋白的活性位點(圖5)，設置活性區域的直徑為9.0?，這個球形足以覆蓋BRDT與JQ1結合位點的關鍵氨基酸殘基。將JQ1與BRDT的活性口袋按照Libdock模塊進行對接(圖6)，得分值為118.924，以此分值作為確定陽性化合物的標準。隨后將經藥效團模型初篩得到的8 937個陽性化合物與BRDT的活性口袋按照Libdock對接方式進行虛擬對接，將對接結果按照從高到低排列，對接結果打分值高于118的化合物有350個。

A：藥效團模型和起作用的氨基酸殘基；B：藥效團模型與JQ1的匹配結果；C：藥效團模型同BRDT-JQ1晶體復合物的匹配結果。BRDT活性位點附近的氨基酸殘基用棒狀表示，綠色箭頭表示氫鍵作用；藥效團模型的藥效特征元素顏色表示：綠色：氫鍵受體；藍色：疏水特征，灰色：排除體積圖4　藥效團模型的結構特征分析

紅色球表示BRDT的活性位點，紅色條帶表示BRDT蛋白鏈圖5　BRDT的活性位點示意圖

紅色條帶表示BRDT蛋白鏈，棒狀結構為JQ1 圖6　JQ1與BRDT的對接圖

四、化合物蛋白水平篩選

用BRDT Bromodomain TR-FRET Assay方法，對經虛擬篩選得到350個陽性化合物進行蛋白水平的測定。該試劑盒運用JQ1作為陽性對照。首先我們摸索了反應的合適條件，得到了JQ1的量效關系曲線如圖7所示。我們將在化合物濃度100 μmol/L時抑制率大于30%的定為陽性樣品，經過3次重復篩選，得到1個對BRDT與乙酰賴氨酸的結合有抑制作用的化合物T480，圖8顯示了這個化合物的化學結構，其抑制率結果見表2。化合物T480屬于唑類小分子化合物，我們將其命名為3-(4-氯苯基)-1-苯基吡唑-4-N-(1-苯基四氮唑)-5-甲基甲胺，可以通過購買得到。

圖7　JQ1的量效關系曲線

圖8　陽性化合物T480的化學結構

化合物樣品號抑制率(%)虛擬對接分數IC50(μmol/L)T48065.53109.5189.020JQ170.34118.9240.133

討論

睪丸特異性含溴結構域蛋白(BRDT)在精子發生過程的在核染色質重組中起關鍵作用，BRDT的第一個溴結構域BD1缺失導致圓形精子細胞錯誤伸長、精子形態嚴重缺陷，精母細胞和精子細胞缺乏全長的BRDT將會導致轉錄和可變剪接過程發生改變[13]。因此，BRDT是精子發生過程中所必需的。此外，BRDT蛋白只在睪丸細胞中特異表達，在有絲分裂生成的精原細胞中不存在，這樣BRDT特異性抑制劑不會影響精子發生的干細胞的數量，理論上說可以使精子發生具有可逆性[14]。基于BRDT在精子發生過程中的關鍵作用，及其不同尋常的高度組織特異性，使其有可能成為發展新型男性抗生育藥物的潛在靶點。

本研究集合計算機虛擬篩選水平和BRDT體外蛋白水平抑制作用測定，進行男性抗生育藥物的理性化篩選，大大提高了篩選效率，節約了篩選成本。計算機藥物虛擬篩選技術是20 世紀后期發展起來的新藥發現新技術，近年來引起了研究機構和制藥公司的高度重視[15-16]，并且已經成為一種與高通量篩選互補的實用化工具，加入到了創新藥物研究的工作流程(pipeline)中。它的介入改變了藥物篩選的模式，從原先的“體外(in vitro)篩選→體內(in vivo)篩選”變為“虛擬(in silico)篩選→體外(in vitro)篩選→體內(in vivo)”，與傳統高通量篩選相比，它具有高效、快速、經濟等優勢[17]。人BRDT的三維晶體結構于2013年已經報道，為本研究開展虛擬篩選提供良好的契機。本研究利用計算機虛擬篩選技術在短時間內對約4萬個化合物進行了篩選，并進行了蛋白水平活性驗證，得到了對人BRDT有潛在抑制作用的小分子抑制劑，這樣大大縮小了化合物的篩選范圍，提高了篩選效率，不足之處是可能會漏篩掉很多好的化合物，但是這種方法對龐大的化合物數據庫還是比較可行的。

本研究篩選到1個陽性化合物T480，結構較為新穎，可以購買得到，為我們進一步開發新的BRDT抑制劑提供借鑒作用；但該化合物的毒性及對精子發生的抑制活性還需要進行動物體內活性驗證。

綜上所述，本研究通過Discovery studio 3.0軟件，建立起靶向人BRDT的藥效團模型和Libdock分子對接虛擬篩選模型，運用其對大規模化合物數據庫進行篩選；隨后，運用蛋白水平篩選模型對虛擬篩選得到的陽性化合物進行復篩，最終得到了1個人BRDT的小分子抑制劑。本研究所采用的分層次多步驟理性化篩選策略，可以揚長避短，顯著縮短藥物篩選的時間，大大提高藥物發現的幾率。

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[編輯：郭永]

Discovery of male anti-fertility inhibitors target BRDT through structure-based virtual screening

GAO Na-na1，2，HOU Li2，ZHOU Yue2，XIN Ling2，YANG Duo1，LI Na1，WANG Hui-ping2*

1.CentralLaboratory，BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing1000382.DepartmentofReproductiveImmunology，NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

【Abstract】Objective： To structure-based virtual screen the inhibitors of human testis-specific and bromodomain containing protein (BRDT).

Key words：Testis-specific bromodomain-containing protein (BRDT)；Male antifertility；Spermatogenesis；Virtual screening

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.012

【收稿日期】2016-02-19；【修回日期】2016-03-16

【基金項目】中央級公益科研院所基本科研業務費專項(2012GJSSJKB01)；中國博士后科學基金(2014M550678)

【作者簡介】高娜娜，女，山東濰坊人，博士，男性抗生育藥物篩選專業.(*通訊作者)