苦參堿抑制LPS誘導巨噬細胞IL-1β、TNF-α分泌及機制研究

楊雪梅　吳　剛

(恩施土家族苗族自治州中心醫院，恩施445000)

苦參堿抑制LPS誘導巨噬細胞IL-1β、TNF-α分泌及機制研究

楊雪梅吳剛①

(恩施土家族苗族自治州中心醫院，恩施445000)

[摘要]目的：探討苦參堿抑制脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS) 誘導巨噬細胞分泌炎癥因子包括腫瘤壞死因子α (TNF-α) 、白細胞介素1β ( IL-1β)對Toll 樣受體4(TLR4) 、c-Jun 表達的影響。方法：購買并培養小鼠RAW264.7 巨噬細胞株，分成四組，即空白對照組、苦參堿組、LPS組、苦參堿干預組，通過濃度為100 μg /L 的LPS DMEM孵育1 h，之后將LPS棄去，然后加入不含血清的DMEM 或125.25 mg /L 苦參堿DMEM 繼續培養。分別收集上述四組細胞處理完畢后5、30、60、120 min 的細胞及培養液。通過PCR法檢測小鼠RAW264.7巨噬細胞TLR4及c-Jun mRNA 的表達，通過免疫細胞化學法檢測小鼠RAW264.7巨噬細胞c-Jun 蛋白的表達；通過ELISA法測定各組培養液中TNF-α、IL-1β的分泌。結果：苦參堿誘導組與空白對照組相比，TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達量和TNF-α及IL-1β分泌量各項指標差異無統計學意義(P>0.05)；LPS組各個時間點TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達量和TNF-α及IL-1β分泌量明顯高于空白對照組，且高水平能夠維持2 h以上(P<0.05)；苦參堿干預組能夠有效的抑制LPS誘導的巨噬細胞TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達量，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β 的分泌量。結論：苦參堿可能通過抑制LPS誘導的巨噬細胞絲裂原活化的蛋白激酶信號通路上TLR4、c-Jun的過表達從而有效的降低終末炎癥因子TNF-α及IL-1β的釋放，進而有效的抑制炎癥反應，減輕內毒素炎癥反應的程度。

[關鍵詞]苦參堿；脂多糖；巨噬細胞；TLR4；c-Jun；IL-1β；TNF-α

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是細菌內毒素的主要成分，可以誘導炎癥因子IL-1β、TNF-α 等的表達，導致組織受到損傷[1,2]。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是巨噬細胞表明的受體，LPS通過識別該受體刺激信號傳導，進一步激活轉錄因子細胞內激活子蛋白1、核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)，誘導炎癥因子的表達[3]。c-Jun 是AP-1 的主要成分之一，是AP-1 的主要活性形式，主要參與LPS 胞內信號轉導及轉錄調控。

苦參堿是中藥苦參、山豆根和苦豆子的主要成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、鎮靜及強心等多方面作用[4]，有學者研究結果顯示能夠有效的抑制機體的炎癥反應[5,6]。本研究探討苦參堿抑制LPS誘導巨噬細胞分泌炎癥因子包括TNF-α 、IL-1β對TLR4、c-Jun 表達的影響。

1材料與方法

1.1材料小鼠RAW264.7 巨噬細胞株從北京生命科學院購買，苦參堿(含量>99%，熔點75.5～77.5℃)購自寧夏制藥廠；LPS購自Sigma 公司；多克隆抗體兔抗小鼠c-Jun、DMEM 高糖培養基購自Gibco 公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；反轉錄PCR 試劑盒購自Promega 公司；TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒購自廣州英韋創津生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RAW264.7 巨噬細胞培養將RAW264.7 巨噬細胞凍存細胞復蘇后，置于含有100 ml/L的胎牛血清的DMEM高糖培養基上在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，細胞達到對數生長期，融合至80%以上時，將培養細胞進行分組，即空白對照組、苦參堿組、LPS誘導組、苦參堿干預組，空白對照組使用不含有血清的DMEM對細胞進行孵育，苦參堿組用濃度為125.25 mg/L的苦參堿DMEM培養基對細胞進行孵育，LPS組及苦參堿干預組分別以濃度為100 μg/L LPS 的DMEM高糖培養基孵育1 h后，將LPS丟棄，之后分別加入無血清DMEM 或濃度為125.25 mg/L 苦參堿的DMEM 繼續進行培養，四組細胞在不同時間點后將培養液及細胞收集。

1.2.2反轉錄PCR對巨噬細胞TLR4、c-Jun mRNA表達的檢測將處理過的細胞采用4℃ PBS漂洗3次后，用細胞刮刀將細胞刮去并收集到EP 管中，根據RNA提取試劑盒的步驟進行提取RNA，并對其純度及完整性進行檢測。之后根據逆轉錄試劑盒的說明合成cDNA。引物由xxx公司設計合成，引物序列如表1所示。

表1反轉錄PCR基因引物序列及產物堿基數

Tab.1Primer seqnences for RT-PCR and size of gene product

GenePrimerSize(bp)TLR4-Forward5'-TCTGCCTTCACTACAGAGACT-3'TLR4-Reveres5'-AGTCTTCTCCAGAAGATGTGC-3'318c-Jun-Forward5'-CGGACCGTTCTATGACTGC-3'c-Jun-Reveres5'-AGCGTGTTCTGGCTATGC-3'394β-actin-Forward5'-TTGTTACCAACTGGGACG-3'β-actin-Reveres5'-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3'662

PCR反應體系由10 μl 5×緩沖液、2 μl 25 mmol/L MgSO4、1 μl 10 mmol/L dNTP、2 μl上游引物和下游引物、1 μl AMV 逆轉錄酶、1 μl DNA 聚合酶、1 μl 1 ng/μl RNA、32 μl焦碳酸二乙酯處理水組成；反應結束后進行半定量分析，表達方式為目的基因RNA量/β-actin量。

1.2.3免疫細胞化學法測定巨噬細胞c-Jun的表達對處理過的巨噬細胞在室溫下用濃度為40 g/L 多聚甲醛固定30 min，PBS處理30 min、過氧化氫(30 ml/L)封閉10 min、山羊血清(50 ml/L)封閉10 min；加兔抗小鼠c-Jun抗體(1∶200)37℃孵育2 h，洗滌后加山羊抗兔IgG二抗(1∶200)，37℃孵育1.5 h；經過顯色、復染、封片及圖片采集后判讀結果，即c-Jun陽性細胞細胞核內為棕黃色，c-Jun陰性細胞細胞核內著色為藍色。計算3個高倍鏡視野下所有細胞及c-Jun陽性細胞，計算c-Jun陽性細胞率。

1.2.4ELISA法測定培養液中炎癥因子IL-1β，TNF-α 的含量按照ELISA試劑盒說明書檢測收集的培養液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。

2結果

2.1苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞TLR4 mRNA表達影響研究從圖1和表2中可以看出TLR4 mRNA表達量在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經過誘導后5 min，TLR4 mRNA表達量瞬間達到高峰，2 h內始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預組在苦參堿處理后5 min，TLR4 mRNA表達量明顯降低，隨著時間的推移，在30、60、120 min 時與LPS組相同時間點相比差異有統計學意義(P<0.05)，120 min時，mRNA表達量仍明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞c-Jun mRNA表達影響研究從圖2及表3中可以看出c-Jun mRNA 表達在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經過誘導后5 min，c-Jun mRNA表達量瞬間達到高峰，2 h內始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預組在苦參堿處理后5 min，TLR4 mRNA表達量明顯降低，隨著時間的推移，而僅在120 min 時與LPS組相同時間點相比差異有統計學意義(P<0.05)，與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3苦參堿對LPS誘導后的小鼠巨噬細胞c-Jun 蛋白表達水平的影響從表4中可以看出c-Jun 陽性細胞數在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經過誘導后5 min，c-Jun 陽性細胞數目瞬間達到高峰，2 h內始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預組在苦參堿處理后5 min，c-Jun 陽性細胞數目明顯降低，隨著時間的推移，在30、60、120 min 時與LPS組相同時間點相比差異有統計學意義(P<0.05)，至120 min時，c-Jun 陽性細胞數目與空白對照組陽性細胞數相當，相比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1　苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞TLR4 mRNA表達影響Fig.1　Matrine promotes TLR4 mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS Note: M.Marker；1.Control group；2.LPS group；3.Matrine group；4.Matrine intervention group.

圖2　苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞c-Jun mRNA表達影響Fig.2　Matrine promotes c-Jun mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS Note: M.Marker；1.Control group；2.LPS group；3.Matrine group；4.Matrine intervention group.

2.4苦參堿對LPS 誘導后小鼠巨噬細胞培養液中IL-1β 水平的影響從表5中可以看出IL-1β在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經過誘導后5 min，IL-1β水平瞬間達到高峰，2 h內始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與LPS組相比，苦參堿干預組在苦參堿處理后5 min，IL-1β明顯降低，隨著時間的推移，在60、120 min 時與LPS組相同時間點相比差異有統計學意義(P<0.05)；苦參堿干預組各時間點的IL-1β 含量明顯高于空白對照組，相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5苦參堿對LPS 誘導后小鼠巨噬細胞培養液中TNF-α 水平的影響從表6中可以看出TNF-α在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經過誘導后5 min，TNF-α水平瞬間達到高峰，2 h內始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預組在苦參堿處理后5 min，TNF-α明顯降低，隨著時間的推移，與LPS組相同時間點相比差異有統計學意義(P<0.05)；苦參堿干預組各時間點TNF-α 含量高于空白對照組對照組，相比差異有統計學意義(P<0.05)。

表2苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞TLR4 mRNA表達影響

Tab.2Matrine promotes TLR4 mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS

GroupsTLR4mRNA5min30min60min120minControlgroup0.40±0.050.40±0.050.40±0.050.39±0.04LPSgroup0.72±0.091)0.71±0.081)0.77±0.061)0.76±0.081)Matrinegroup0.40±0.020.43±0.030.42±0.030.43±0.02Matrineinterventiongroup0.68±0.083)0.55±0.072)3)0.51±0.062)3)0.47±0.052)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group.

表3苦參堿對LPS誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞c-Jun mRNA表達影響

Tab.3Matrine promotes c-Jun mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS

Groupsc-JunmRNA5min30min60min120minControlgroup0.30±0.040.35±0.040.39±0.030.38±0.03LPSgroup0.81±0.111)0.80±0.121)0.77±0.131)0.82±0.121)Matrinegroup0.33±0.020.34±0.030.32±0.030.33±0.02Matrineinterventiongroup0.78±0.063)0.44±0.072)3)0.42±0.062)3)0.41±0.042)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表4苦參堿對LPS誘導后的小鼠巨噬細胞c-Jun蛋白表達水平的影響(%)

Tab.4Matrine promotes c-Jun protein expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(%)

Groupsc-Junprotein5min30min60min120minControlgroup19.11±2.9320.02±3.0120.01±2.9420.05±2.96LPSgroup54.23±7.821)55.77±8.011)56.18±8.021)53.79±8.221)Matrinegroup19.22±2.6720.07±2.9820.02±2.9620.08±2.98Matrineinterventiongroup49.33±7.633)33.55±4.762)3)24.71±3.912)3)21.33±3.322)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表5苦參堿對LPS 誘導后小鼠巨噬細胞培養液中IL-1β 水平的影響(pg/ml)

Tab.5Matrine promotes IL-1β expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(pg/ml)

GroupsIL-1β5min30min60min120minControlgroup9.11±1.939.02±2.019.01±1.949.05±1.96LPSgroup48.32±6.821)47.77±7.011)49.18±7.021)49.79±7.221)Matrinegroup9.22±1.679.07±1.989.02±1.969.08±1.95Matrineinterventiongroup46.35±7.662)3)38.57±4.782)3)28.75±3.912)3)19.34±2.972)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表6苦參堿對LPS 誘導后小鼠巨噬細胞培養液中TNF-α 水平的影響(μg/ml)

Tab.6Matrine promotes TNF-α expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(μg/ml)

GroupsTNF-α5min30min60min120minControlgroup0.23±0.030.24±0.040.26±0.030.26±0.02LPSgroup0.86±0.091)0.89±0.081)0.88±1.011)0.87±0.091)Matrinegroup0.24±0.020.25±0.030.25±0.020.27±0.03Matrineinterventiongroup0.76±0.062)3)0.63±0.052)3)0.55±0.042)3)0.38±0.022)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group.

3討論

機體內一種重要的免疫細胞是巨噬細胞，它是機體免疫防御作用的一道重要防線，巨噬細胞表面有眾多病原相關分子模式的模式識別受體。在這些模式識別受體中，TLR4 顯得較為重要，是重要的模式識別受體之一。而LPS 是G-菌的主要的病原相關分子模式[7]。眾所周知，G-菌侵入到機體死亡后，菌體裂解釋放大量的LS到機體血液系統內，LPS即可結合到與血液中游離的巨噬細胞膜表面TLR4上，從而有效的激活巨噬細胞內的絲裂原活化的蛋白激酶和NF-κB等相關信號轉導通路。MAPK相關信號通路通過LPS被激活，激活后的信號通路上的c-JunN 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活化使c-Jun蛋白N-末端磷酸化，使AP-1形成。AP-1一種穩定的異源二聚體，主要通過Jun與Fos 蛋白相互嵌合形成的，是細胞中的一種活性形式，AP-1結合位點位于基因啟動子區域，AP-1可以結合到該位點，從而使炎癥因子相關基因的轉錄活性增強，使IL-1β、TNF-α炎癥因子表達增強[8-10]。有學者研究顯示通過有效阻斷TLR4 及AP-1的激活能夠有效的降低LPS導致的炎癥反應[11-14]。

苦參堿是豆科植物苦參中的重要的成分之一，具有廣泛的藥理作用，目前已在臨床上廣泛應用[15]，有學者研究顯示苦參堿能顯著抑制小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF,以及細菌脂多糖誘導的大鼠肝臟枯否細胞釋放TNF 和IL-6 ,并能降低小鼠血清TNF 和IL-6 水平,從而有效的減輕肝臟、腎臟及肺臟等組織器官炎性損傷[16，17]。TNF-α、IL-1β是眾多的炎癥因子中學者們關注較多的炎癥介質，主要與內毒素造成疾病有關[18]。本研究通過LPS誘導小鼠巨噬細胞1 h后，在轉至無血清DMEM 經過5 min的培養后，炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌已經達到高峰，且維持2 h保持不變。當給予LPS誘導的巨噬細胞苦參堿處理5 min后發現，炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌明顯降低，說明，苦參堿對與LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌具有明顯的抑制作用，且隨著時間的推移，對炎癥因子的抑制作用越強，這也進一步說明苦參堿是通過抑制炎癥因子的過表達而參與了機體的抗炎癥反應的過程。

LPS 誘導巨噬細胞1 h后，再轉至無血清DMEM中培養5 min后，炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達趨勢與TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白表達趨勢基本一致，說明TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun的表達與炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達有明顯的相關性。故通過抑制TLR4、c-Jun 基因及蛋白的表達，能夠有效的改善內毒素血癥患者最后的結局，本研究通過苦參堿干預LPS誘導巨噬細胞，結果顯示在苦參堿干預5 min時，LPS誘導的巨噬細胞TLR4、c-Jun 的mRNA 轉錄及c-Jun 蛋白表達明顯降低，雖然苦參堿對TLR4、c-Jun 的mRNA 轉錄及c-Jun 蛋白發揮抑制作用顯示的時間點有所不同，但從總體上來說是一致的，說明苦參堿抑制LPS造成的炎癥因子的過表達與絲裂原活化的蛋白激酶通路有相關性。本研究結果顯示LPS誘導巨噬細胞1 h后再加入苦參堿培養5 min后，TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白表達與空白對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，表明苦參堿能夠有效的抑制絲裂原活化的蛋白激酶通路上TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達，進而抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達。

總之，苦參堿可能通過抑制LPS誘導的巨噬細胞絲裂原活化的蛋白激酶信號通路上TLR4、 c-Jun的過表達從而有效的降低終末炎癥因子IL-1β、TNF-α 的釋放，進而有效的抑制炎癥反應，減輕內毒素炎癥反應的程度。

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[收稿2015-09-22修回2015-11-12]

(編輯許四平)

Inhibitory effect of Matrine on IL-1β，TNF-α of macrophages induced by LPS

YANG Xue-Mei,WU Gang.

Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of Matrine on inhibiting lipopolysaccharide(lipopolysaccharide ，LPS) - induced macrophages to secrete inflammatory cytokines,including tumor necrosis factor-α (TNF-α),leukocyte mediated element 1β (IL-1β) on Toll like receptor 4 (TLR4),c-jun expression.Methods: Cultured macrophage RAW264.7 of mouse and divided into four groups,including blank control group,matrine group,LPS group,matrine intervention group.Incubated by the concentration was 100 μg/L LPS DMEM for 1 h,then the LPS was discard.Added free serum DMEM or 125.25 mg/L matrine DMEM to culture.The cells and culture solution of 5,30,60,120 min after the treatment of the above four groups were collected respectively.Detected of mouse RAW264.7 macrophage TLR4 and c-jun mRNA expression by PCR.Detected of mouse macrophage RAW264.7 cells c-jun protein expression by immunocytochemical.Measured secretion in cultured solution of TNF-α and IL-1β by ELISA.Results: Expression TLR4 mRNA,c-jun mRNA and c-jun protein and TNF -α and IL-1β secretion quantity indexes of matrine induced and blank group had no statistical significant differences (P>0.05).TLR4 mRNA，c-jun mRNA and c-jun protein expression secretion of and TNF-α and IL-1β LPS group at each time point were significantly higher than that of blank group,and the high level to maintain more than 2 h (P<0.05);matrine intervention group could effectively inhibit LPS induced macrophage TLR4 mRNA,c-jun mRNA and c-jun protein expression and reduce the secretion of inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β.Conclusion: Matrine may inhibit LPS induced macrophage mitogen activated protein kinase signal pathway of TLR4 and c-jun expression so that it can effectively reduce the end inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β release,effectively inhibit the inflammatory reaction and reduce the degree of endotoxin inflammatory response.

[Key words]Matrine;Lipopolysaccharide;Macrophage;TLR4;c-Jun;IL-1β;TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.011

作者簡介：楊雪梅(1969年-),女,副主任藥師，主要從事醫院藥學方面的研究，E-mail:yxm1969_22@sina.com。

中圖分類號R967

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0820-05

①湖北民族學院醫學院基礎教研室，恩施445000。