熱原及其檢測方法的研究進展

郭春雪

摘要：目的：對熱原物質及其檢測方法進行闡述。方法：通過對熱原物質本質的分析，總結藥典要求的家兔熱原檢測法和內毒素檢測法的優缺點，并根據兩種常用檢測方法使用存在的局限性，簡要介紹新的熱原檢測法-細胞檢測法。結果與結論：家兔法和內毒素檢測法的影響因素限制了檢測方法的使用范圍，新的檢測方法拓寬了檢測范圍，實現標準化，但仍需要進一步驗證和論證，故需要進一步完善熱原檢測方法，實現藥品的使用安全。

關鍵詞：熱原物質 熱原檢測方法 研究

中圖分類號：R286 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）02（b）-0000-00

熱原在韋伯斯特字典中曾被定義為致熱劑，是指由微生物進入血液循環系統時引起恒溫動物體溫異常升高的致熱性物質，包括內毒素，革蘭氏陽性細胞碎片、真菌和病毒等。目前普遍認為熱原所引起的發熱反應主要是由革蘭氏陰性細菌所產生的內毒素（脂多糖）引起的，因其存在的普遍性、穩定性和相對的致熱性，內毒素的檢測又可以保護人和動物避免發生有害反應（敗血癥），故FDA和USP指南要求所有非經腸道藥品和醫療器械的終產品都要做內毒素檢測，使產品不因內毒素而效力降低[1]，但是嚴格意義上說，不是每一種熱原都具有脂多糖結構，所以，隨著生物技術的發展，熱原的檢測方法已經從動物試驗、定性試驗發展到定量試驗，也已經從廣泛應用鱟血細胞檢測發展到利用人源細胞檢測。

1 熱原的定義

在 15至16世紀，實驗醫學界充滿著關于靜脈注射療法的諸多報道，起因于許多病人經靜脈注射后都伴隨著發熱反應，直到18世紀丹麥生物學家panum的研究中斷定，引起這種發熱反應其實是一種對熱穩定，溶于水但不溶于乙醇，由活的細菌中由來的一類物質，微量注射后就可引起高熱反應，1923年至1925年美國科學家Florence Seibert證實了所有的注射發熱反應都是由可過濾、熱穩定的革蘭氏陰性細菌產生的物質造成的，隨后Rademaker進一步證實了seibert的發現，并共同確立了使用家兔檢測注射劑及穩定生產靜脈注射液的方法。細菌內毒素革蘭氏陰性細菌細胞外壁層上的特有結構，在生活狀態時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶或粘附在其他細胞時才表現出毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖，其水溶性好，耐熱性穩定，核酸多糖的高分子結構也不易被破壞。在機體水平上的活性主要表現為發熱性、致死毒性和血小板減少等。 熱原即發熱性物質，廣義上說是所有引起恒溫動物體溫異常升高物質的總稱，除內毒素引起發熱外，其實還包括病毒，干擾素以及其他種種發熱物質，所以，所有可以引起熱原反應的物質都是熱原檢測的范疇

2 熱原的檢測方法

2.1 家兔熱原檢查

家兔熱原檢查法是1942年首次被收載于《美國藥典》12版，半個世紀以來也一直作為法定熱原檢查的權威標準為各國藥典所采用，該方法是將一定劑量的供試品靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以此判定供試品所含熱原的限度是否符合規定。該方法優點是家兔與人類所引起的發熱反應的最小內素素幾乎相當，并且家兔還具有繁殖容易，使用、注射方便等特點，該方法不但能檢測出細菌內毒素的致熱原，也能檢測出非細菌內毒的致熱原[2]，并且適用于檢查較多種類的熱原物質，仍是目前我國藥品和生物制品質量評價中常用的方法。同時該方法也受到多種因素影響檢測結果，家兔體溫的穩定性和均一性是家兔檢測熱原的一個重要的因素，但是由于受到飼養環境、實驗環境、家兔個體差異和種屬差異的影響，家兔的體溫很維持在所需要的范圍內，此外，使用活體動物費用較高，重復性差，應用范圍有限，也不符合3R原則[即減少（reduction）、替代（replace）和優化（refinement） [3]，該方法本身又是一種不能定量的限度試驗，因此建立一種準確、規范的定量檢測熱原方法勢在必行。

2.2 細菌內毒素檢測法

細菌內毒素檢測法（Bacterial Endotoxin Test，BET）是由美國科學家Drs.Frederick B.Bang和Jack Levin創建的，于1980年被正式收載于《美國藥典》20版，也被稱作鱟試劑檢測法，鱟試劑是使用美洲鱟的阿米巴細胞的溶胞物質制備的，因此取名為Llus Amebocyte Lysate（LAL），BET是基于鱟試劑與內毒素發生特異性反應，形成凝膠或顯色來判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法，是控制藥品質量的一項重要檢測項目，該方法的優點是操作簡單，結果快速可靠，靈敏度較兔法高10倍以上，試驗成本低廉，最重要的是可以利用細菌內毒素標準品（Endotoxin Standard）對供試品進行定量或半定量檢測，應用范圍廣泛。但是該方法最大的缺點是只能對革蘭氏陰性細菌產生的細菌內毒素進行檢測，此外，由于鱟資源有限，鱟試劑又易受外界條件干擾，如PH值，溫度等，發生假陽性的幾率較高，所以目前還不能完全取代家兔檢測法。

2.3 細胞檢測法

隨著基因治療產品、新生物材料及中藥注射劑等新制品的不斷增加，家兔熱原檢測法和BET法本身存在的局限性，以及公眾對動物保護的呼聲日益高漲，因此研究新的熱原檢測法是一種趨勢。研究發現外源性發熱物質能刺激免疫細胞分泌一些與發熱有關的細胞因子，通過酶聯免疫法對相關細胞因子進行定量檢測就能確定外源性熱原的存在與否及存在含量[4]，這是進行新方法研究的依據，根據細胞的不同來源和種類可分為三大類：人來源血液或細胞法、其他動物來源血液或細胞法、細胞模型。與傳統方法相比較，新的檢測方法具有BET高靈敏度和家兔法寬檢測譜，檢測費用更加低廉，更能反映人體對不同種熱原的反應，填補了傳統方法的空白，更大程度的保證了人體臨床用藥的安全。盡管目前已經有7中新檢測方法得到歐洲權威機構，英國國家生物制品檢定所得正式驗證和推薦，但是仍有很多不足之處，如對細胞產生毒副作用或增值抑制作用的藥物，對細胞因子有干擾作用的制品等，因此，新熱原檢測方法還需要進一步的完善。

總之，隨著細胞生物學技術和分子生物學技術的日益發展和應用，利用細胞檢測法對供試品進行熱原檢測是國際研究熱原物質的必然趨勢，新檢測方法的進一步論證與家兔法、細菌內毒素法的逐步改善必會更加完善熱原的檢測方法，使其更加準確。

參考文獻

[1]秦媛媛，吳彥霖，劉倩，等. 三類體外熱原檢測方法的研究進展[J]. 中國藥事，2012，26（5） ：507-512

[2 ]沈娟，武向鋒，王文俊，等. 家兔細菌內毒素致熱的靈敏度變化研究[J]. 解放軍藥學學報，2009，25（5）： 441-443.

[3 ]Thomas Hartung，Ingeborg Asberge，Susanne Berthold，etal. Novel pyrogen tests based on the human fever reaction the report and recommendations of ecvam workshop[J]. Alter Lab Animals，2001，（29）：99-123.

[4]譚德講，任珺，杜穎，等.熱原和熱原檢測方法的研究進展[J].藥物分析雜志，2004，24（6）：653-659