短發(fā)夾RNA干擾CXCR4表達對卵巢癌SKOV3細胞凋亡及侵襲能力的影響*

賴　靖, 訾　聃, 楊英捷

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院, 貴州 貴陽　550004； 3.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽　550004)

短發(fā)夾RNA干擾CXCR4表達對卵巢癌SKOV3細胞凋亡及侵襲能力的影響*

賴靖1, 訾聃2**, 楊英捷3

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院, 貴州 貴陽550004； 3.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾趨化因子受體4(CXCR4)表達對卵巢癌細胞株SKOV3侵襲能力及細胞凋亡的影響。方法： 將帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SKOV3，設計特異shRNA將其連入慢病毒載體；測序及熒光顯微鏡下觀察綠色熒光驗證慢病毒載體構建并轉(zhuǎn)染，利用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞株中CXCR4的mRNA表達，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞株中CXCR4、促凋亡蛋白Bax、B細胞白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-xl及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的蛋白表達；Annexin V/PE雙染色流式細胞術檢測SKOV3細胞凋亡率，Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞株SKOV3的侵襲力。結果： 測序結果及微下見綠色熒光蛋白表達，證實成功構建慢病毒載體并轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SKOV3，成功將特異shCXCR4連入載體；shCXCR4組mRNA及蛋白表達水平明顯低于NC組(P<0.05)；干擾細胞中CXCR4的表達能提高SKOV3細胞中Bax及Cleaved caspase-3蛋白的表達量，降低Bcl-xl與Bcl-2的蛋白表達，干擾后，SKOV3細胞凋亡率，shCXCR4組細胞凋亡率較CON組和NC組明顯增高(P<0.05)；穿膜的細胞數(shù)明顯減少，抑制率為58.94%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論： 慢病毒干擾載體pLVshCXCR4-EGFP(2A)-Puro轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SKOV3，可以下調(diào)細胞株中CXCR4的表達，并能促進卵巢癌細胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌細胞的侵襲能力。

[關鍵詞]卵巢腫瘤； 趨化因子受體4； RNA干擾； 細胞凋亡； 侵襲能力[中圖分類號] R711.75； R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0653-07

卵巢癌是婦科發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，居婦科腫瘤病死率的首位，一直威脅著婦女的生命健康[1]。由于卵巢位居盆腔深部使得卵巢癌初期癥狀不明顯，且缺乏早期診斷依據(jù)，易造成浸潤轉(zhuǎn)移，這也是卵巢癌病死率較高的首要原因。 趨化因子(Chemokine)是一類具備趨化活性的細胞因子，能被腫瘤細胞所分泌，增進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2-5]。趨化因子12(chemokine ligand 12，CXCL12)，也稱基質(zhì)細胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)與趨化因子受體4(chemokine CXC motif receptor 4，CXCR4)構成CXCR4/SDF-1生物軸，介導細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導。有研究證實，CXCR4在卵巢癌細胞中高表達[6]，并且在卵巢癌的浸潤中有著重要的作用。RNA干擾(RNA interference ，RNAi)是目前分子生物領域興起的一項干擾技術，能夠特異的降解相應基因的mRNA，使細胞的目的基因缺失或使其表達量下調(diào)[7]；Bcl-2(B-cell-leukemia/Lymphoma-2)與Bax(Bcl-2 Associated X Protein)基因是目前已知的在凋亡過程中功能相互對立的一組調(diào)控基因[8-9]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)是凋亡過程中最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，因此，3者的關系已成為進來研究細胞凋亡的熱點。本研究期望能夠通過RNAi技術下調(diào)CXCR4的表達，探討短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾CXCR4的表達對卵巢癌細胞株SKOV3侵襲能力以及細胞凋亡的影響，以期為卵巢癌的治療找到一個新的靶點。

1材料和方法

1.1細胞株與慢病毒載體

人卵巢癌細胞株SKOV3購于北京北納生物科技有限公司；慢病毒載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro，含U6啟動子及綠色熒光蛋白基因，購自北京英盛茂業(yè)生物有限公司。

1.2主要試劑

RPMI-1640 購自Gibco公司，胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，PBS、青霉素/鏈霉素購自北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一步法WB(HRP)快速二抗試劑盒(鼠)購自北京康為世紀生物有限公司，Polyfect-v轉(zhuǎn)染試劑購自北京英盛茂業(yè)生物有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國OMEGA公司，封閉蛋白干粉購自博士德公司，TRIZOL 試劑購自Invitrogen公司，SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司，Bax鼠抗人多克隆抗體、Bcl-2鼠抗人多克隆抗體、Bcl-xl鼠抗人多克隆抗體、cleaved caspase-3兔抗人多克隆抗體購于美國cell signaling Technology公司，含有基質(zhì)膠的Transwell小室購自美國Corning公司，引物合成及基因測序由北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司完成。

1.3實驗分組

實驗分為3組：CON組(空白組)轉(zhuǎn)染pLV shRNA-EGFP(2A)Puro的卵巢癌細胞株SKOV3，NC組(陰性組)轉(zhuǎn)染無義序列的pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro的卵巢癌細胞株SKOV3和shCXCR4組 (實驗組)轉(zhuǎn)染pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro卵巢癌細胞株SKOV3。

1.4實驗方法

1.4.1CXCR4特異性干擾序列Genebank檢測CXCR4(序列號NM_003467)基因序列，The RNAi Consortium網(wǎng)站設計干擾序列4條(其中1條為陰性序列，3條為特異性干擾序列，)經(jīng)美國國立生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫進行序列檢索，檢測基因序列無同源性后交由北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司合成(表1)。

1.4.2構建pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro載體、病毒的包裝及滴度測定將合成的CXCR4干擾序列互補雙鏈退火，慢病毒載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro進行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，將退火的雙鏈連入酶切的載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，挑取克隆送測序。測序無誤后進行病毒包裝及滴度的測定。

1.4.3細胞培養(yǎng)卵巢癌細胞株SKOV3于RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，2～3 d換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.4CXCR4 mRNA表達取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，細胞密度為1×1010/L進行轉(zhuǎn)染。病毒滴度為1×109TU/L，按MOI=病毒滴度×需加入的體積/細胞濃度，在3組細胞中分別加入50 μL病毒液，常規(guī)培養(yǎng)6 h后再次加入培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前先計數(shù)細胞數(shù)，轉(zhuǎn)染24 h后，利用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP表達，GFP陽性細胞表達綠色熒光，計數(shù)GFP陽性細胞，選取轉(zhuǎn)染效率高的一組CXCR4陽性序列進行下一步實驗。轉(zhuǎn)染24 h后以TRIZOL法提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，并進行定量PCR反應。待測基因引物序列CXCR4 F為GGTCTATGTTGGCGTCTGGAT，R為TGAGGATGACTGTGGTCTTGAG β-actin F為CATTGCCGACAGGATGCAG，R為CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG。1.4.5CXCR4、Bax、BCL-xl、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白表達將轉(zhuǎn)染后的3組細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細胞，BCA試劑盒對細胞裂解進行蛋白定量，并測定總蛋白濃度，以30 μL/泳道上樣，按常規(guī)方法進行Western blot檢測。

1.4.6SiRNA對SKOV3細胞凋亡的影響消化收集各組細胞，細胞濃度約為1×107個/L，用PBS重懸細胞，吹打均勻后加入AnnexinV溶液混勻，室溫避光孵育10～15 min，離心，PBS洗滌細胞，重懸細胞，加入PE染色細胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式細胞儀分析凋亡率。

1.4.7Transwell小室檢測細胞侵襲能力將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 μL預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠再水化，20 min后吸去培養(yǎng)液。病毒轉(zhuǎn)染細胞后常規(guī)培養(yǎng)24 h，撤去培養(yǎng)基中的血清使細胞饑餓12 h，調(diào)整細胞密度至 1×108個/L，不超過5×108個/L，上室加入細胞懸液，下室加入含有趨化因子及血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗濾膜表面，固定細胞，倒置Transwell小室，自然風干后細胞染色計數(shù)。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro載體測序

將插入干擾序列的載體送測序，測序結果與設計的靶序列完全相符(圖1)，表明靶向沉默基因shCXCR4表達載體構建成功。

2.2pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro轉(zhuǎn)染SKOV3

載體pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro攜帶綠色熒光表達基因，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達。選取轉(zhuǎn)染效率較高的shCXCR4-3組(圖2)及NC組進行下一步實驗。

2.3特異性CXCR4shRNA對SKOV3細胞CXCR4mRNA表達的抑制作用

RT-qPCR和2-ΔΔCT法分析SKOV3中CXCR4的mRNA相對表達量，shCXCR4組較NC組的mRNA的表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；NC組與CON組比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖1　構建的shCXCR4 表達載體測序結果Fig.1　Expression medium sequencing of constructed shCXCR4

注：A為轉(zhuǎn)染前倒置顯微鏡下SKOV3細胞，B為轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下SKOV3細胞圖2　慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染SKOV3細胞 (10×)Fig.2　Transfection of SKOV3cells with lentivirus vector

(1)與NC組相比，P<0.05圖3　CXCR4 shRNA對卵巢癌SKOV3細胞CXCR4 mRNA 表達的影響Fig.3　Influence of CXCR4 shRNA on expression of ovarian cancer SKOV3 cell CXCR4 mRNA

2.4特異性CXCR4shRNA對SKOV3細胞CXCR4、Bax、Bcl-xl、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白表達的影響

與NC組比較，shCXCR4組CXCR4蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CON組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4；與NC組比較，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達升高，而Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.5下調(diào)CXCR4對SKOV3細胞凋亡的影響

通過AnnexinV和PE雙重標記后上流式檢測結果顯示，shCXCR4組轉(zhuǎn)染后凋亡率(13.53±2.69)%較CON組(4.97±1.71)%和NC組(4.63±1.10)%明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而CON組及NC組的細胞凋亡率分布無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

2.6干擾CXCR4表達對卵巢癌細胞侵襲能力的影響

Transwell小室檢測干擾CXCR4表達后,細胞的穿膜數(shù)，shCXCR4組每視野為(22.184±2.185)，抑制率為58.94%，抑制率明顯高出NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NC組(57.133±3.214)抑制率為-5.78%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，shCXCR4組SKOV3細胞的穿膜數(shù)較NC組明顯降低(P<0.05)，見圖7。

(1) 與NC組比較，P<0.05圖4　CXCR4 shRNA對卵巢癌SKOV3細胞CXCR4蛋白表達的影響Fig.4　Influence of CXCR4 shRNA on protein expression of ovarian cancer SKOV3 cell CXCR4 mRNA

(1)與NC組比較，P<0.05圖5　Bax與Bcl-2、Bcl-xl及cleaved caspase-3的蛋白表達水平Fig.5　Downregulated CXCR4, expression of SKOV3 cell strains Bax與Bcl-2, Bcl-xl and cleaved caspase-3

圖6　SKOV3細胞凋亡率(AnnexinV和PE雙標流式細胞儀)Fig.6　Apoptosis rate of SKOV3

圖7　干擾CXCR4表達后SKOV3細胞的穿膜數(shù)(Transwell小室)Fig.7　Transwell of interfered expression of CXCR4

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率較高，占女性惡性腫瘤的五分之一，因其易發(fā)生浸潤及遠處轉(zhuǎn)移，致死率位居婦科腫瘤的首位，5年存活率低于50%[10]。趨化因子能夠增加內(nèi)皮細胞的聚集，下調(diào)免疫監(jiān)視，調(diào)整腫瘤細胞的外形從而使腫瘤細胞躲避免疫監(jiān)視，增進自身的發(fā)展，以此獲取遠處轉(zhuǎn)移能力[11]；CXCR4能產(chǎn)生趨化性，并伴隨著細胞重排、肌動蛋白聚合、極化、形成偽足和黏附作用，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]，CXCR4在多種惡性腫瘤中被檢測出，且存在高表達，被證實與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關[13]。研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤中較少或無CXCR4表達，而在卵巢上皮性囊腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中存在CXCR4的高表達，且在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中表達趨勢明顯高于原發(fā)灶[14]；并且與卵巢癌淋巴結的轉(zhuǎn)移存在正相關[15-16]。本研究采用卵巢癌細胞株SKOV3進行實驗，證實了在卵巢癌細胞株SKOV3上存在CXCR4的高表達，并且該表達能夠被特異性干擾片段下調(diào)。這與蔣玉萍等[17]采用CXCR4阻斷劑在體外能夠阻斷其表達相一致，這表明，在卵巢癌細胞上高表達的CXCR4能夠被特異性SiRNA及CXCR4拮抗劑下調(diào)。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序性死亡，細胞凋亡與胚胎發(fā)育、自身免疫耐受、腫瘤發(fā)生、病毒感染等生理、病理過程密切相關。細胞凋亡可通過流式細胞儀、DNA凝膠電泳等多種方法檢測。在細胞凋亡過程中，Bcl家族成員起著至關重要的作用。其分為2大類，一類是抗凋亡的主要有Bcl-2，Bcl-xl，另一類是促細胞死亡的，主要包括Bax，Bcl-XS等，Bcl-2與Bax是目前研究較深入的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2是凋亡抑制基因，其活性增高，可抑制細胞凋亡，延長細胞生命[18]。Bax是一種促凋亡基因，抑制細胞增值，因此通過這兩種基因表達的檢測，能反映出細胞的凋亡[19]。本實驗通過流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，在下調(diào)CXCR4的表達后，shCXCR4組的細胞凋亡率(13.53±2.69)%明顯高于NC組(4.63±1.10)%及CON組(4.97±1.71)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在WB檢測Bax、Bcl-xl、Bcl-2及cleavedcaspase-3蛋白表達的結果中得出，在shCXCR4組抗凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達較CON組及NC組明顯減少，而Bax在shCXCR4的表達則反之；凋亡是一個發(fā)生在由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應過程，即caspase在凋亡信號的作用下，啟動型caspase先通過結合特異輔因子而激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應型caspase，一旦效應caspase被激活，便大范圍的水解細胞內(nèi)靶物質(zhì)，從而降解細胞內(nèi)蛋白，最終使細胞不可逆走向死亡[20]，而caspase-3就位于級聯(lián)反應的下游，執(zhí)行剪切細胞結構蛋白的作用，直接使細胞發(fā)生死亡；在本實驗中，下調(diào)CXCR4后，cleavedcaspase-3被激活，降解腫瘤細胞內(nèi)蛋白，促使細胞凋亡的發(fā)生。Katkoori[21]的研究顯示，在實驗中利用CXCR4的拮抗劑下調(diào)CXCR4后，能夠誘導乳腺癌細胞及直腸癌細胞的凋亡，并能有效地降低其增殖與遷移能力；在Hamdan[22]對尤文氏肉瘤的研究中，利用AMD3100拮抗CXCR4的表達能夠引起骨髓細胞的凋亡的同時能夠減少腫瘤血管的灌注；我們的結果與其他的研究結果相同，下調(diào)CXCR4可誘導細胞的凋亡。

CXCR4在卵巢癌中的作用還與其促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力有關[23]。細胞外基質(zhì)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要屏障，其主要由基底膜和細胞間質(zhì)組成。CXCR4可以誘導動員細胞內(nèi)鈣離子，活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK-1/2)，使MMP-9分泌增加，IV型膠原酶纖維被降解，破壞基底膜并誘導新生血管的形成，腫瘤局部的微環(huán)境被重新建立，使腫瘤細胞更易獲得轉(zhuǎn)移性[24]。本研究在實驗中下調(diào)了卵巢癌細胞上CXCR4的表達，在此基礎上又進行了侵襲能力的檢驗，shCXCR4組細胞穿膜數(shù) (22.184±2.185)，與CON組 (54.018±2.368)及NC組( 57.133±3.214)相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；由此可得出，腫瘤細胞上CXCR4的表達降低后其侵襲能力較未干擾前有了明顯降低，這與之前關于下調(diào)CXCR4降低腫瘤細胞侵襲能力的研究結論相符。

卵巢癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，治療后易復發(fā)的特點是臨床治療的一個難點。本研究表明，利用特異性shRNA能夠?qū)XCR4進行有效干擾，這或許能成為卵巢癌治療的一個新的理論依據(jù)。

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(2016-03-05收稿，2016-05-21修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Influence of Lentivirus-Mediated shRNA-CXCR4 on Ovarian Cancer Cell Apoptosis and Invasion

LAI Jing1, ZI Dan2, YANG Yingjie3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouTumorHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the influence of CXCR4-targeted short hairpin RNA on invasion ability and apoptosis of ovarian cancer line SKOV3. Methods: CXCR4-shRNA lentivirus with Green fluorescent protein was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3. RT-qPCR and western blot were employed to measure the expression of CXCR4 RNA and protein expression of CXCR4, Bax, Bcl-2, Bcl-xl and Caspase-3. Apoptosis rate of SKOV3 cell was detected through Annexin V/PE double staining flow cytometry. Transwell chamber was employed to estimate the invasiveness for SKOV3. Results: Transfected pLVshCXCR4-EGFP (2A)-Puro. 2.CXCR4 RNA expression level and protein in ShCXCR4 group was (0.40±0.13) and (0.45±0.23) ，respectively lower than that in NC group (1.109±0.21, P<0.05). Interference of CXCR4 expression in cells can increase Bax and Cleaved caspase-3 protein expression in SKOV3 cells, reduced the Bcl-xl and the Bcl-2 protein expression. Flow cytometry instrument was adopted to detect cell apoptosis rate, shCXCR4 group was significantly higher than that of NC group and CON group, difference was statistically significant(P<0.05); in invasion test ,cell number of ShCXCR4 group was obviously lower than that in NC group and CON group, inhibition rate of shCXCR4 group was 58.94%, difference was statistically significant(P<0.01). Conclusion: CXCR4 RNA interference mediated with pLVshCXCR4-EGFP (2A)-Puro could effectively downregulate the expression of CXCR4 RNA, and promote the cancer cell apoptosis as well as decrease the invasion ability of cancer cells.

[Key words]ovarian cancer; chemokine receptor 4; RNA interfence; apoptosis; invasion

*[基金項目]貴州省科技廳聯(lián)合基[黔科合LG(2011)032號]

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.008

**通信作者 E-mail:2816497455@qq.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1715.044.html