miR-590-5P通過下調靶基因S100A10表達、抑制Wnt信號通道調控肝癌細胞增殖*

范仁根查文章周勇周建平單湘湘

?

miR-590-5P通過下調靶基因S100A10表達、抑制Wnt信號通道調控肝癌細胞增殖*

范仁根①查文章①周勇①周建平①單湘湘①

【摘要】目的：研究miR-590-5P對肝癌細胞增殖能力的影響以及參與HCC發生發展的機制。方法：利用QPCR對肝癌細胞株miR-590-5P的表達譜系進行分析和驗證，生物信息技術預測S100A10可作為miR-590-5P的潛在靶基因，并通過實時定量PCR以及Western blot進行驗證。通過慢病毒載體在肝癌細胞株HepG2中過表達miR-590-5P，CCK-8法檢測轉染后細胞增殖，流式細胞技術檢測轉染后細胞周期變化，Western blot檢測轉染后細胞Wnt信號相關蛋白表達水平。結果：熒光定量檢測結果顯示，miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達，而S100A10蛋白在肝癌細胞中高表達。S100A10 3’UTR luciferase 報告系統驗證表明，miR-590-5P可以通過結合S100A10 3’UTR而抑制報告基因的表達。通過慢病毒系統在HepG2細胞中高表達miR-590-5P，可有效抑制S100A10基因的表達。在肝癌細胞HepG2中過表達miR-590-5P，可通過調控細胞周期，明顯抑制Wnt信號相關蛋白：Wnt5a、cMyc、CyclinD1的表達水平，促進E-cadherin、Caspase3的表達，加速β-catenin蛋白的磷酸化，而調控細胞增殖。結論：miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達，而S100A10基因在人肝癌細胞中過表達，S100A10為miR-590-5P的靶基因。miR-590-5P在肝癌細胞中過表達，可有效抑制S100A10基因的表達，抑制Wnt通路的激活，使腫瘤細胞停滯在G1期，從而參與肝癌細胞增殖進程。

【關鍵詞】miR-590-5P； 肝癌細胞

①江蘇省鹽城市第一人民醫院 江蘇 鹽城 224000

Medical Innovation of China， 2016，13（16）：004-008

First-author's address：First People's Hospital of Yancheng City，Yancheng 224000，China

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進化上保守，大小為20～25個核苷酸（nucleotide，nt）的非編碼小RNA。成熟的miRNA與其靶信使RNA3’端UTR完全或不完全配對后，通過切割或抑制靶mRNA的轉錄后翻譯，參與調節生物的發育、細胞的分化、增殖和凋亡等，并與人類腫瘤的發生發展密切相關［1］。miRNA的發現為基因表達調控研究打開了新的窗口，異常表達的miRNA及其靶基因的發現不僅豐富了腫瘤的發病機制，也為探索新的基因靶向治療提供依據［2］。S100A10（又名P11）是S100鈣結合蛋白家族成員之一，是一種鈣依賴性的信號通路的介導分子，在多種腫瘤細胞中表達異常［3］。S100A10蛋白在Annexin Ⅱ介導的生物膜的聚集和融合過程中具有重要作用，參與Annexin Ⅱ四聚體形式介導的質膜循環，在腫瘤的發生發展進程中具有重要意義。筆者通過檢測HCC癌與癌旁臨床樣本（10例）中S100A10表達，顯示大部分HCC腫瘤組織S100A10較癌旁組織高表達，而miR-590-5P較癌旁組織低表達，提示S100A10、miR-590-5P與HCC的發生發展密切相關。本文擬通過分子生物和細胞技術探討miR-590-5P調控肝癌細胞增殖和細胞周期的潛在機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料 人肝細胞性肝癌細胞株QGY-7701、HepG2、SK-HEP-1、SMMC-7721、BEL-7402、Li-7（湘雅醫學院細胞庫），DMEM培養基（Gibco），胎牛血清FBS（Gibco），Lipofectamine 2000（Invitrogen），miR-590-5P/3P定量PCR引物（上海生工），DH5a感受態細胞（寶生物工程有限公司），慢病毒實驗系統、慢病毒表達載體（System Biosciences公司）。0.25%胰蛋白酶-EDTA （Hyclone），RIPA裂解液（sigma），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce），ECL發光試劑盒（GE），顯影膠片（KODAK），鼠S100A10抗體（Abcam），鼠Wnt-5a單抗（Abcam），鼠cMyc單抗（abcam），鼠Cyclin D1單抗（Santa cruz），鼠Caspase 3單抗（Santa cruz）、鼠β-catenin單抗（Santa cruz），雙熒光報告載體、雙熒光報告系統檢測試劑盒（Promega），限制性內切酶（NEB），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa），DNA凝膠純化試劑盒、DNA產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒（天根）。

1.2儀器 DU800核酸蛋白分析儀（Beckman），凝膠成像系統（上海培清科技），實時熒光定量PCR擴增儀（Bio-Rad），流式細胞儀（FACS Calibur，BD），PCR儀器（SENSO），冷凍低溫離心機（黑馬HEMR），組合式電泳、電轉系統（Bio-Rad），超凈工作臺，37 ℃細胞培養箱，電熱恒溫水槽（上海恒科技），化學發光儀（Promega）。

1.3方法

1.3.1QPCR檢測方法 以snRNA U6 作為miRNA QPCR的檢測內參，其中U6上游引物為：TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物為：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA，引物為生工生物工程（上海）股份有限公司購買，反應條件參照試劑說明書相應體系進行操作，結果通過以snRNA U6為內參計算2-ΔΔCT值比較各組miRNA表達差異。

1.3.2Western blot 使用RIPA裂解液裂解各組細胞，通過BCA蛋白定量試劑盒行蛋白定量，取20 μg的總蛋白行12% SDS-PAGE膠，120 V恒壓電泳（約1.5 h），轉膜、封閉和孵育抗體，通過HRP-ECL法，用X光膠片曝光，檢測各實驗組S100A10、Wnt5a，cMyc，Cyclin D1，Caspase 3 and phosphorylation levels of β-catenin、β-actin（內參）蛋白表達水平。

1.3.3細胞轉染 參照Lipofectamine 2000說明書進行轉染，轉染后48 h檢測轉染水平。

1.3.4細胞增殖功能檢測（CCK-8法） 消化并收集各組細胞以1×103種于96孔板中，體積100 μL/孔，按照不同時間點（0、24、48 h）加入CCK-8（CK04，同仁化學），震蕩10 min后置酶標儀上檢測490 nm處吸光度值。

1.3.5細胞周期檢測 收集各組細胞，預冷PBS （pH=7.4）洗滌兩次，離心，收集細胞沉淀；加入預冷70%乙醇，于4 ℃放置過夜。PBS洗滌細胞兩次，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，加入100 μL PBS（含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A），4 ℃避光常溫孵育30 min，上機（FACS Calibur，BD）檢測。

1.4統計學處理 使用SPSS 15.0統計軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達，而S100A10在肝癌細胞中高表達 QPCR、Western blot分別用于檢測miR-590-5P、S100A10在不同肝癌細胞株和正常肝細胞株中的表達水平。mir-590-5P在所有肝癌細胞株中的表達水平明顯低于正常肝細胞株（L-02）（P＜0.01），見圖1。而S100A10在所有肝癌細胞株中的表達水平明顯高于正常肝細胞株（L-02）（P＜0.01），結果提示：miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達、S100A10在肝癌細胞中高表達，見圖2。而生物信息學預測miR-590-5P在S100A10保守位點有高分數結合，因此可將其作為重要的候選靶基因，見圖3。

圖1　人肝癌細胞株中miR-590-5P含量

圖2　Western blotting檢測不同肝癌細胞株中S100A10蛋白含量

圖3　miR-590-5P與S100A10靶位點及突變位點配對圖

2.2miR-590-5P可以通過與靶基因S100A10的3’UTR直接作用下調其表達 構建pcDNA-miR-590-5P重組表達載體及pS100A10A-3’UTR-PGL3報告基因重組質粒，S100A10 3’UTR Luciferase報告系統驗證表明，miR-590-5P可以通過結合S100A10 3'UTR而抑制報告基因的表達，將預測的結合位點突變，其抑制效應也隨即消失，提示：miR-590可以通過與靶基因S100A10的3’UTR直接作用下調其表達，見圖4。此外，筆者通過慢性病毒系統在HepG2細胞中轉染Lv-miR-590-5P，通過QPCR和Western blot對轉染效率進行檢測，發現miR-590-5P 在HepG2細胞中過表達，且能有效抑制S100A10的表達，見圖5～6。

圖4　S100A10 3’UTR Luciferase報告分析

圖5　各組miR590-5P的表達水平

圖6　各組S100A10蛋白的表達水平

2.3HepG2細胞株中過表達miR-590-5P可明顯抑制細胞的增殖活性，使其細胞周期發生停滯HEPG2分別轉染miR-590-5P和空白質粒，CCK-8法檢測細胞活性，與空白對照組相比較，在HepG2細胞中過表達miR-590-5P，可以明顯抑制腫瘤細胞的增值活性。同時筆者研究示：HepG2細胞株轉染Lv-miR-590-5P 24、48 h后，與對照組細胞數比較差異無統計學意義（P＞0.05）；而72 h后，轉染后HepG2細胞數較對照組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖7。因此筆者認為miR-590-5P通過時間依賴機制（細胞周期改變）抑制肝癌細胞增殖，基于此筆者通過流式細胞儀檢測Lv-miR-590-5P轉染后細胞周期分布，發現與對照組相比，其可以使細胞明顯阻滯于G1期，見圖8。

2.4HepG2細胞株中過表達mir-590-5P可抑制Wnt信號通道 在HepG2細胞中過表達miR-590-5P，可抑制Wnt信號相關蛋白：Wnt5A、c-Myc、CyclinD1、MMP7的表達，同時上調E-cadherin、Caspase3蛋白的表達，促進β-catenin蛋白的磷酸化水平，見圖9。

圖7　 基因干預后各組細胞數情況

圖8　細胞周期檢測

圖9　Western blot檢測HepG2細胞過表達miR-590-5P及Wnt信號相關蛋白表達水平

3　討論

miRNA作為一類具有調節作用的小RNA，它調節人體內1/3的信使RNA（mRNA）的表達，且參與人體內包括腫瘤發生在內的多種生物學過程［4］。近來，越來越多的研究表明miRNA在腫瘤細胞增殖、凋亡途徑中發揮重要作用。已有研究表明，miR-21、miR-375、miR-224、miR-195、miR-15b等miRNA可通過直接或間接調控靶基因影響細胞的增殖、凋亡以及侵襲和轉移，進而參與HCC的發生、發展［5-7］。Chung等［8］發現miRNA-15b可通過抑制腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）誘導的死亡受體凋亡通路，而抑制HCC細胞凋亡。GUO等［9］發現在激活的肝星狀細胞中高表達miRNA-15/16，可負向凋節靶點Bcl-2，進而激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9，從而通過死亡受體、線粒體介導的凋亡通路誘導激活的肝衛星干細胞凋亡。Wu等［10］研究表明：miR-184可抑制SOX7表達而調控肝癌細胞增殖。而miR-590-5P位于人類基因組7號染色體長臂近端，且研究表明：miR-590的兩個臂5P和3P在HCC發生發展中發揮重要作用［11］。筆者的研究表明，在肝癌細胞中miR-590-5P低表達，并通過生物信息學發現其靶基因S100A10。

為了探索miR-590-5P對HCC細胞功能的影響，筆者通過在人HCC細胞系HepG2細胞中轉染miR-590-5P寡聚核苷酸，上調miR-590-5P 在HepG2細胞中的表達，發現miR-590-5P促進β-catenin磷酸化、抑制c-Myc、CyclinD1蛋白表達，誘導細胞阻滯在G1期，而顯著抑制細胞增殖。

Wnt/β-catenin信號通路是一條進化過程中高度保守的信號通路，以轉錄輔助因子β-catenin為主要介導因子，Wnt/β-catenin信號紊亂與肝癌等發生發展密切相關［12］。許多腫瘤細胞中存在Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨?，持續激活的β-catenin可以促進下游靶基因，如CyclinD1、c-Myc等表達增高，從而引起細胞增殖［13-14］。同時肝癌細胞株中過表達miR-590-5P，Caspase3表達明顯增加，這表明miR-590-5P可活化Caspase3途徑，參與HepG2細胞凋亡，表明在體外實驗中，miR-590-5P參與HepG2細胞的增殖及凋亡進程［15］。然而這些實驗效果只是建立在一種細胞模型中，因此需要更多的實驗來驗證。

參考文獻

［1］ Bartel D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［2］鄭驚雷，梁力建，王在國，等.肝動脈灌注化療抑制肝癌血管生成的研究［J］.中國醫學創新，2014，11（3）：1-3.

［3］張維，高云升.S100A8在胃癌中的表達及臨床意義［J］.中國醫學創新，2012，9（3）：17-18.

［4］曾鳳枝.MiRNA及其與肺癌早期診斷的新認識［J］.中國醫學創新，2012，9（30）：154-156.

［5］ Bota J，Chivalric R R，O’Donnell K A.Therapeutic miRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model［J］.Cell，2009，137（6）：1005-1017.

［6］ Liu A M，Poon R T，Luk J M.miRNA-375 targets Hipposignaling effector YAP in liver cancer and inhibits tumor properties［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，16（3）：623-627.

［7］ Garcon M，Dileva G，Romano.miRNA221 and miRNA-222 regulate TRALL resistance and enhance tumorigenicity through PTEN and TIMP3 nonregulated［J］.Cancer Cell，2009，25（6）：498-509.

［8］ Chung G E，Mung S J，Lee S H.High expression of miRNA15b predicts a low risk of tumor recurrence following curative resection of hepatocellular carcinoma［J］.Colon Report，2010，32（1）：113-119.

［9］ Guo C J，Pan Q，Li D G.miR-15b and miR-16 are implicated in activation of the rat hepatic stellatc cell：An esscntial role for apoptosis［J］.Journal of Hepatology，2009，13（4）：766-778.

［10］ Wu G G，Li W H，He W G，et al.Mir-184 post-transcriptionally regulates SOX7 expression and promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma［J］.PLoS One，2014，9（2）：e88 796.

［11］楊紅飛，鄭文宏，趙文淘，等.miR-590-5P和miR-590-3P參與肝細胞肝癌發展的機制［J］.南方醫學大學學報，2013，33（6）：804-811.

［12］ Seidler H B，Utsuyama M，Nagaoka S，et al.Expression level of Wnt signaling components possibly influences the biological behavior of colorectal cancer in different age groups［J］.Exp Mol Pathol，2004，76（3）：224-233.

［13］周威，熊奇如.Wnt/β-catenin信號通路重要分子及其靶基因在原發性肝癌中的作用機制［J］.肝膽外科雜志，2013，21 （2）：150-155.

［14］ Nusse R.Wnt signaling in disease and in devdopment［J］.Cell Res，2005，15（1）：28-32.

［15］高艷麗，劉曉華，趙衍江，等.腫瘤標志物檢測肝癌血清的陽性率與臨床意義［J］.中國醫學創新，2013，10（3）：94-95.

MiR-590-5P Inhibits Growth of HepG2 Cells via Decreasing S100A10 Expression and Inhibiting Wnt Pathway

FAN Ren-gen，CHA Wen-zhang，ZHOU Yong，et al

【Key words】MiR-590-5P； Hepatoma cell

【Abstract】Objective：To study the effect of miR-590-5P on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and the mechanism involved in the occurrence and development of HCC.Method：The QPCR was used on hepatocellular carcinoma cell line miR-590-5P expression spectrum analysis and verification，the bioinformaticsprediction S100A10 as miR-590-5P potential target genes and verified by quantitative real-time PCR and Western blot.By lentiviral vector in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells over expressing miR-590-5P，detected by CCK-8 assay after transfection cell proliferation，flow cytometry was transfected into the cell cycle.After transfection，the cells Wnt signaling associated protein expression levels were detected by Western blot.Result：The results of fluorescence quantitative analysis showed that miR-590-5P was low expressed in human hepatocellular carcinoma cells，while S100A10 protein was highly expressed in hepatocellular carcinoma cells.3’UTR luciferase S100A10 reporting system validation showed that miR-590-5P can inhibit the expression of the reporter gene by binding to 3’UTR S100A10.The expression of S100A10 gene could be effectively inhibited by high expression of miR-590-5P in HepG2 cells through the slow virus system.In human hepatoma HepG2 cells overexpressing miR-590-5P，through the regulation of cell cycle，inhibit Wnt signaling related proteins： Wnt5a，cmyc and CyclinD1 expression level，promoted the expression of E-cadherin and Caspase3，acceleration of beta catenin protein phosphorylation，and regulation cell proliferation.Conclusion：MiR-590-5P in human hepatocellular carcinoma cells in low expression，and S100A10 gene in human hepatocellular carcinoma cells over expression，S100A10 for the miR-590-5P target gene.Overexpression of miR-590-5P in hepatocellular carcinoma cells can effectively inhibit the expression of S100A10 gene，inhibit the activation of Wnt pathway，so that the tumor cells in the G1 phase of stagnation，so as to participate in the process of proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.002

*基金項目：鹽城市科技局、鹽城市衛生局科技計劃項目（YK2014010）

通信作者：單湘湘

收稿日期：（2015-11-26） （本文編輯：周亞杰）