云南部分蘭科植物多糖的提取及含量測定

趙會然，王玉珍，許瑞嵐，宗莉莉，胡　軍，郭　潔

（大理大學藥學與化學學院，云南大理　671000）

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云南部分蘭科植物多糖的提取及含量測定

趙會然，王玉珍，許瑞嵐，宗莉莉，胡軍，郭潔*

（大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

［摘要］目的：建立云南部分蘭科植物多糖含量測定的方法，并對其提取工藝進行研究。方法：采用傳統水提取方法提取多糖，以葡萄糖為標準品，用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，并以其為考察指標，采用提取條件的優化篩選最佳提取工藝。結果：葡萄糖在0.000～0.020 mg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為A=55.55c（mg/mL）+ 0.001（r=0.999 8），平均加標回收率為99.7%，RSD=3.13%（n=6）；最佳顯色條件：苯酚用量1.0 mL、濃硫酸用量7.0 mL、顯色溫度80℃、顯色時間30 min；提取蘭科植物多糖的最佳工藝條件為：提取溫度70℃，料液比1：40，提取時間2 h。結論：該方法簡便、準確，優選出的提取工藝重復性好。

［關鍵詞］蘭科植物；多糖；提取條件；含量測定；苯酚-硫酸法

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 04. 007

蘭科（Orchidaceac）約700屬，20 000～35 000種〔1〕，主要分布在熱帶地區〔2〕。中國有194屬，1 388種，而云南、臺灣和海南島居多，其中云南目前有151屬，709種〔3〕，在各省區中居第1位，故有“植物王國”的美譽。蘭科植物中的石斛、天麻、白芨、芋蘭、杜鵑蘭等是重要的中藥材。石斛的主要藥用成分為多糖和生物堿等〔4〕，而植物多糖因有增強和調節機體免疫功能，抗衰老，抗腫瘤，抗輻射等作用而受到廣泛的重視〔5-6〕。石斛混淆品眾多，包括石斛屬外的金石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬和貝母蘭屬等植物〔7〕，但其藥用物質基礎尚不明確，不利于這些藥用植物的深度開發或質量標準的建立，有必要對其物質基礎進行深入的研究。

經過查閱文獻資料，篩選出部分云南產蘭科植物作為研究對象，對這些植物中多糖含量的研究尚未見報道。本文用苯酚-硫酸法〔8〕對這些石斛混淆品的多糖含量進行測定，為進一步開發和利用蘭科植物提供參考依據。

1　材料與方法

1.1儀器RE-5203旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；AL204電子天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SZCL-2數顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2試劑無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸，以上試劑均為分析純。

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖250.0 mg，以適量蒸餾水溶解并轉移至250 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準儲備液。取5 mL濃度為1 mg/mL葡萄糖溶液至50 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，備用。

5%苯酚溶液的配制：在40℃的溫度下，溶解部分苯酚，再向溶解的苯酚中加入0.1 g鋁片進行常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取苯酚餾分5.0 g，用適量蒸餾水溶解，轉移至100 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，然后將其轉移至100 mL棕色瓶中，即得5%苯酚溶液，備用。

1.3樣品蘭科植物：滇西貝母蘭Coelogynecalcicola；喉紅石斛Dendrobium christyanum；密花毛蘭Eriaspicata；鐮翅羊耳蒜Liparis bootanensis；溫氏卷瓣蘭Bulbophyllum wendlandianum。把各株植被分開，再單獨烘干，粉碎，過孔徑0.30 mm篩，備用。以上樣品均采購于云南大理三月街藥材市場，由昆明植物研究所胡江苗副研究員鑒定。

樣品溶液的配制：分別準確稱取5.000 0 g樣品粉末，置于圓底燒瓶中，依次加入200 mL蒸餾水，在70℃的水浴中加熱提取1 h，重復提取2次，合并提取液并濃縮至20 mL左右，冷卻至室溫后加入3倍體積的95%乙醇，搖勻，在4℃下放置12 h，抽濾，風干得粗多糖。稱取粗多糖0.025 0 g，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，即得樣品溶液。

1.4方法分別取適量試液和空白液置于干燥的具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，然后加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冰水中，沿試管壁緩慢加入濃H2SO47.0 mL，待冷卻后，在冰水中搖勻。然后放入80℃水浴中加熱30 min，流水冷卻至室溫。在選定波長下，以試劑空白為參比，測定試液的吸光度。

1.5實驗條件的選擇

1.5.1測定波長的選擇取適量葡萄糖標準溶液、滇西貝母蘭提取液、蒸餾水，按實驗方法顯色后，以蒸餾水為參比，在400～600 nm波長內分別測繪3種溶液的吸收曲線。見圖1。結果表明，葡萄糖和樣品提取液均在488 nm處有最大吸收。因此以488 nm作為測定波長。

圖1　吸收曲線

1.5.2試劑用量、顯色溫度、顯色時間的選擇分別考察了苯酚用量、濃H2SO4用量、顯色溫度和顯色時間對測定結果的影響。在選定波長下測定試液吸光度。實驗結果表明：5%苯酚溶液用量在0.9～1.0 mL、濃H2SO4用量在6.5～7.5 mL、顯色溫度在60～90℃、顯色時間在10～50 min范圍內，測定體系的吸光度較大且基本不變，所以確定5%苯酚用量為1.0 mL、濃H2SO4用量為7.0 mL、顯色溫度為70℃、顯色時間為30 min作為最佳測定條件。

1.5.3精密度和穩定性實驗移取樣品溶液1.0 mL，分別置于6個10 mL具塞比色管中，按實驗方法顯色后，測定吸光度，計算RSD=2.00%（n=6）。實驗表明，在選定的測定條件下，測定體系在室溫下至少穩定2 h。

2　結果

2.1標準曲線的繪制分別取葡萄糖標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL至干燥的具塞比色管中，按實驗方法、在選定實驗條件下測定試液的吸光度并測繪制標準曲線。結果表明，在葡萄糖含量為0.000～0.020 mg/mL范圍內，試液的吸光度與葡萄糖濃度有良好的線性關系，線性回歸方程為A=55.55c（mg/mL）-0.001，相關系數r= 0.999 8。

2.2樣品溶液多糖含量的測定移取1.0 mL樣品溶液，按實驗方法、在選定條件下顯色后測定吸光度，從標準曲線方程中計算多糖的含量，平行測定6次，取平均值。見表1。

表1　樣品中多糖含量測定結果（n=6）

由表1可知，不同樣品中多糖的含量有差異，其中滇西貝母蘭的多糖含量最高，鐮翅羊耳蒜的多糖含量最低。

2.3加標回收實驗移取適量樣品溶液，分別加入0.02、0.08 mg葡萄糖，進行回收率測定（n=6）。平均回收率為99.7%，RSD=3.13%。結果表明該實驗方法準確度高。見表2。

2.4樣品中多糖提取條件的優化

2.4.1粗多糖的提取流程樣品粉末→加適量水后加熱提取→抽濾→合并提取液→濃縮→加入適量95%乙醇在4℃下醇沉12 h→抽濾→風干→稱重。

2.4.2提取條件的優化考察提取溫度、提取時間、料液比、提取次數對提取率的影響，實驗結果表明，提取率隨提取溫度、提取時間、料液比、提取次數的增加均有所增加，當溫度增加到70℃后，提取率稍有下降；提取時間增加到2 h后、料液比增大到1：40以上、提取次數增加到2次以上，提取率基本不變。因此選定提取溫度為70℃，提取時間為2 h，料液比為1：40，為節約時間及降低能耗，選擇提取次數為2次。

表2　加標回收實驗結果

在選定的提取條件下，分別對不同樣品進行3次平行提取，計算提取率。見表3。

表3　樣品提取率測定結果（n=3）

3　討論

本實驗通過水提醇沉法提取多糖，并優化了提取條件，方法簡便、準確，使樣品中的多糖提取較為完全，保障了后續測定結果準確可靠。實驗采用苯酚-硫酸比色法測定多糖的含量，由精密度實驗、穩定性實驗和加標回收實驗結果表明，方法的精密度、準確度較高，穩定性好，可作為蘭科植物多糖含量測定方法。在實驗過程中發現試液顯色的起始溫度不一致會對測定結果有影響，我們采取在冰水浴中緩慢加入濃硫酸，并在冰水浴中將試液搖勻，保證了顯色起始溫度不受濃硫酸稀釋時放熱的影響，使顯色起始溫度一致，從而使樣品測定結果更準確。

［參考文獻］

〔1〕張殷波，杜昊東，金效華，等.中國野生蘭科植物物種多樣性與地理分布〔J〕.科學通報，2015，60（2）：179-188.

〔2〕楊鴻培，余東莉.云南蘭科植物新資料〔J〕.亞熱帶植物學，2013，42（4）：350-352.

〔3〕金偉濤，向小果，金效華.中國蘭科植物屬的界定：現狀與展望〔J〕.生物多樣性，2015，23（2）：237-242.

〔4〕王建，陶靖，莫瑩，等.廣西不同產地馬鞭石斛多糖含量的測定〔J〕.廣西中醫藥大學學報，2013，16（2）：78-80.

〔5〕劉莉，蕭風回.石斛屬藥用植物多糖研究進展〔J〕.現代中藥研究與實踐，2009，23（1）：77-80.

〔6〕余剛.多糖及石斛多糖研究綜述〔J〕.大眾體育，2013 （66）：148-149.

〔7〕陳業高，徐桃蘋，武荷云.貝母蘭屬植物化學成分及藥理活性研究進展〔J〕.時珍國醫國藥，2006，17（3）：338-339.

〔8〕周躍斌，王偉，周向榮，等.苯酚-硫酸比色法測定毛竹葉多糖的研究〔J〕.現代食品科技，2008，24（2）：180-183.

（責任編輯毛本勇）

Extraction of Polysaccharide and Content Determination of Yunnan Orchidaceae Plants

Zhao Huiran，Wang Yuzhen，Xu Ruilan，Zong Lili，Hu Jun，Guo Jie*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

〔Abstract〕Objective: To establish the method for determining the contents of polysaccharides and to explore the extraction technique for polysaccharides from Yunnan orchidaceae plants. Methods: The polysaccharide was extracted with the traditional water extraction，using glucose as the standard，and the contents of polysaccharides was measured by the phenol-sulfuric acid method. With the content of polysaccharides as an index，the univariate test were performed to find the optimal extraction technique. Results: A good linear relationship with a regression equation of A=55.55c（mg/mL）+0.001（r=0.999 8）was achieved when the concentration of glucose ranged between 0.000 and 0.020 mg/mL. The average recovery rate was 99.7%，and the relative standard deviation was 3.13%（n=6）. The best conditions of color are as follows，the dosage of phenol and sulphuric acid was 1.0 mL and 7.0 mL respectively，temperature of color was at 80℃，and developing time was 30 minutes. The optimal extraction of polysaccharide was performed by 2 hours soaking using 1 : 40 volumes of solvent at 70℃. Conclusion: The established method is simple and accurate and the optimal extraction technique shows good reproducibility.

〔Key words〕Orchidaceae plants；polysaccharide；extraction conditions；determination of content；phenol sulfuric acid method

［中圖分類號］R284.2

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-2266（2016）04-0026-03

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81160393）；大理大學大學生科研基金資助項目（yh201404）

［收稿日期］2016-01-09［修回日期］2016-03-14

［作者簡介］趙會然，碩士研究生，主要從事天然藥物化學研究.

*通信作者：郭潔，教授.