膝骨關節炎不同證型軟骨細胞在t-RNA中的表達*

鄭素明　關俊輝（廣州中醫藥大學第三附屬醫院　廣東廣州5040；廣東省廣州市中醫醫院　廣州5030）

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膝骨關節炎不同證型軟骨細胞在t-RNA中的表達*

鄭素明1關俊輝2
（1廣州中醫藥大學第三附屬醫院廣東廣州510240；2廣東省廣州市中醫醫院廣州510130）

摘要：目的：研究膝骨關節炎不同證型軟骨細胞在t-RNA中的表達情況。方法：選取股骨頭壞死患者30例，按照脾腎兩虛型以及肝腎虧虛型進行辨證分型和分組（各15例）。以實驗室培養不同證型的軟骨細胞作為研究方法，并對不同證型軟骨細胞中t-RNA的表現形式進行觀察，通過染色觀察后，對軟骨組織的表達形式進行研究分析。結果：肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標基因的表達方面均明顯低于脾腎兩虛型組，這表明在基因表達方面兩種證型之間存在明顯的差異。軟骨組織細胞的外在形態由t-RNA的轉錄情況決定，在遞變性的不同證型研究中，軟骨組織的退化主要的原因取決于軟骨組織中t-RNA的轉錄效果。結論：治療膝骨關節炎的臨床癥狀，并改善患者的生活質量，應當從神經遞質以及細胞增生激素來進行局部控制，并以此來抑制或者促進t-RNA的轉錄，只有如此才能夠有效地控制關節組織的退化進度。在改善人體的基本環境后，對人體的組織成長基本情況會有優化作用。在現代臨床治療膝骨關節炎的臨床治療中，應當從人體軟骨組織入手，并以此來作為研究的根本，從細胞核中m-RNA和t-RNA的轉錄作為研究的根本進行臨床試驗的研究分析，必然可以在臨床檢驗研究中得出更直接的證據。

關鍵詞：膝骨關節炎；軟骨細胞；t-RNA；基因表達

膝骨關節炎（Knee Osteoarthritis，KOA）屬于一種慢性炎癥性骨科疾病，致病機理較多，其中包括了工作環境、遺傳以及體內抗原特性，對人體的日常生活會產生較大的影響[1]。KOA的主要并發癥狀就有關節腫脹、壓痛等，并出現伴隨性關節疼痛，且軟骨組織細胞會逐漸退化，進而引起人體的骨質畸形[2]。在對其進行研究的過程中，以核糖核酸的轉錄表達形式進行分析研究。現報告如下：

1　資料和方法

1.1一般資料選擇我院2013年6月～2014年6月就診治療的中老年膝關節炎患者30例的軟骨組織標本，符合WHO對膝關節炎患者的納入標準，按照脾腎兩虛型以及肝腎虧虛型進行辨證分型和分組（各15例）。年齡45～70歲，平均（51.6±7.2）歲，術前未接受任何藥物治療，并簽署了治療知情同意書。排除創傷性膝關節炎、類風濕性關節炎以及其他性質的關節炎，及嚴重器官疾病患者。對患者的軟骨組織進行選取后，可進行分析。

1.2主要試劑及儀器實驗試劑：Trizol（日本Takara公司），RT-PCR試劑（德國DBI公司），DEPC（美國Sigma公司），RNasin（美國Promega公司），逆轉錄試劑盒（德國DBI公司）。實驗儀器：SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州凈化設備公司），UV-1206分光光度計（日本SHIMODZU公司），SCR20B冷凍離心機（日本HITACHI公司），Z323K臺式低溫高速離心機（德國HERMLE公司），TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠），Mini-6K水平離心機（上海安亭科學儀器廠），GDS7600水平式電泳儀（北京東方儀器廠），DF-23B凝膠掃描系統（英國UVP公司），BS210S電子天平（日本Satorius公司），－80℃超低溫保存箱（海爾集團），ABI9700PCR擴增儀（美國ABI公司），Real time PCR儀（美國Agilent公司）。

1.3實驗方法

1.3.1Real time PCR檢測MMP1、MMP13 mRNA的表達變化取適量組織，在液氮中充分研磨，加入1 ml Trizol，震蕩混勻室溫放置5 min；加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，靜置3 min；4℃12 000 rpm離心10 min，把上層水相轉移到新的管中；加入等體積異丙醇，混勻，靜置20 min；4℃12 000 rpm離心10 min，去上清；用1 ml 75%DEPC酒精洗滌沉淀；4℃12 000 rpm離心5 min，棄去液體；室溫晾干后，加入30 μl DEPC處理過的ddH2O水，溶解RNA，-80℃凍存備用。

1.3.2去基因組使用RNase-free的DNase·I （Promega），按RNA 20 μl，DNaseⅠ20 μl，10 x buffer 10 μl，RNase inhibitor 0.5 μl，H2O（RNase free）49.5 μl配置反應液100 μl，37℃消化30 min，65℃滅活10 min。然后加入等體積的苯酚，上下顛倒混勻后10 000 rpm離心5 min，取上清；加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻后10 000 rpm離心10 min，取上清；加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，－20℃靜置15 min；4℃下，10 000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺風干；加入15～40 μl DEPC水溶解沉淀。

1.3.3逆轉錄以2 μg總RNA為模板，按照Bestar qPCR RT Kit說明書配制逆轉錄反應體系，總體系為20 μl，合成cDNA第一鏈。首先按照RNA2.0 μg，DEPC H2O配制反應液10 μl；然后65℃，5 min，冰上急冷；再按上述反應液10 μl，5xRT Buffer RT 4 μl，Enzyme Mix 1 μl，Primer Mix 1 μl，DEPC H2O 4 μl配制反應液20 μl；37℃，60 min；98℃，10 min，合成cDNA第一鏈，并收集備用。

1.3.4PCR檢測Real time PCR擴增的反應體系為20 μl（DBI Bestar SybrGreen qPCRmasterMix），反應體系按照Bestar SybrGreen qPCRmasterMix 10 μl，PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 8 μl模板配制20 μl；PCR反應條件：94℃2 min，94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40循環。融解曲線分析：溫度62～95℃。每個樣本重復3次，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行熒光定量PCR實驗。

1.4數據處理實驗按照2-△△Ct方法處理數據。其中，△Ct=（目的基因Ct-內參Ct）的平均值±標準偏差；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標準偏差（若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進行計算）。

2　結果

2.1兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值比較兩組情況比較，經統計學處理，結果判定當P=0.018＜0.05認為方差不齊。選用Wilcoxon秩和檢驗：Wilcoxon w=1035.00，Z=-8.171，P＜0.001，故差異明顯。

表1　兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值及組間比較（±s）

表1　兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值及組間比較（±s）

組別　n　rt-PCR中MMP1的△Ct值肝腎虧虛型脾腎兩虛型15 15 3.2993±0.42186 1.2038±0.57784

2.2兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值比較兩組情況比較，經統計學處理，結果判定當P=0.01＜0.05認為方差不齊。選用Wilcoxon秩和檢驗：Wilcoxon w=1035.00，Z=－8.171，P＜0.001，故差異明顯。

表2　兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值及組間比較（±s）

表2　兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值及組間比較（±s）

組別　n　rt-PCR中MMP13的△Ct值肝腎虧虛型脾腎兩虛型15 15 3.9147±1.14625 1.2911±0.48166

根據本實驗研究，在實時PCR（real time PCR）檢測組間△Ct值的差異存在明顯異常，Ct值指的就是擴增曲線達到閾值時的循環圈數，而對于循環圈數而言，次數越大表明該基因的表達程度越低。經統計學統計，肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標基因的表達方面均明顯小于脾腎兩虛型組。對軟骨組織細胞培養結果中的表現現象研究，在培養了24 h左右期間的組織細胞中，可清晰地看到核仁，其中部分軟骨組織細胞出現群集生長，而初代軟骨組織在培養到5 d后，細胞呈現多邊形態，并排列緊密。對于不同證型軟骨組織細胞m-RNA表達水平的分析中，從外源性的濃度分析，可得出t-RNA細胞的表現形式，經對比后，外源性濃度出現增加趨勢，和細胞內t-RNA的表達有著直接關系。如果在臨床治療中，能夠有效的抑制t-RNA表達，則可以有效的抑制KOA導致的軟骨組織退化。

3　討論

KOA屬于常見的軟骨組織退化導致的疾病，此處的組織細胞自身并沒有充足的血液供給，并無神經分布，而作為承重的主要組織材料，在承受沖擊力的同時，是保護人體的最主要構成組織[3～4]。在進行形態的表達中，組織細胞通過自身細胞中的基因表達來完成細胞分化，并以此來促進機體的成長。但是伴隨著年齡的增長，人體各機能的退化，都會直接地影響到自身機體的各項組織表達形式。近年來大量研究發現，MMP-1、MMP-13參與了KOA的發病，在其發病機制中起重要作用[5～6]。

MMP家族（MMPs）廣泛存在于各種結締組織中，是一類Zn2+、Ca2+依賴的重要蛋白水解酶家族，在細胞外基質（ECM）的生理和病理降解過程中起重要作用，可有效降解軟骨中細胞外基質，它的異常增高可能是導致ECM合成與降解失衡的重要原因。其中MMP-1和MMP-13具有強烈降解Coll-Ⅱ和蛋白多糖的作用。MMP-1主要由成纖維細胞分泌，可切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅹ型膠原及明膠。MMP-1的活性增強對于軟骨基質的降解起著關鍵性的作用；MMP-13可對各種膠原進行有效降解，其降解Ⅱ型膠原纖維的能力是其他膠原酶的10～30倍，而且其他許多MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過MMP-13起作用。MMP-13是已知最有效的Ⅱ型膠原降解酶，可分解膠原三螺旋結構[7]。

KOA是在人體老化過程中所表現出來的一種常見骨質病癥。在對這一類患者進行治療的過程中，通過注射刺激性藥物，以及消炎性藥物來抑制關節炎癥的并發，很難從根本上緩解患者的機體病狀，僅僅是在生活質量上得到了一定的改善。在本次的臨床調研研究中，我們發現肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標基因的表達方面均明顯小于脾腎兩虛組。這表明在基因表達方面兩種證型之間存在明顯的差異。通過分析不同證型軟骨組織細胞在t-RNA中的表達效果，了解到對于軟骨組織細胞分化的表達，需要通過相關RNA的有機結合，才能夠促進細胞的分化。在此階段中，抑制軟骨組織分化的細胞基液，還需要進行進一步的研究分析，并以此來促進現代臨床治療膝骨關節炎的療效。由于機體促進t-RNA表達的酶活性降低，進而導致分化的細胞因子減少，導致了膝關節內骨贅的產生，從而引發軟骨組織退化。這一機理，對研究膝骨關節炎的臨床治療研究方法，有著舉足輕重的效用，因此在今后的研究中，應當以此作為主要的研究方向進行研究。

綜上所述，治療膝骨關節炎的臨床癥狀，并改善患者的生活質量，應當從神經遞質以及細胞增生激素來進行局部控制，并以此來抑制或者促進t-RNA的轉錄，只有如此才能夠有效地控制關節組織的退化進度。在改善人體的基本環境后，對人體的組織成長基本情況，會有優化作用。在現代臨床治療膝骨關節炎中，應當從人體軟骨組織入手，并以此來作為研究的根本，從細胞核中m-RNA和t-RNA的轉錄作為研究的根本進行臨床試驗的研究分析，必然可以在臨床檢驗研究中得出更直接的證據。

參考文獻

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[3]胡洪亮,曹誼林,劉陽,等.小鼠FasL基因的克隆和在軟骨細胞中表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2003,19(4):326-328,337

[4]張媛,何延輝,王炳南,等.中藥接骨方對骨折愈合過程中骨粘連蛋白信使核糖核酸表達的調控[J].中醫正骨,2012,24(9):11-14

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[7]Hamamura K,Zhang P,Zhao L,et al.Knee loading reduces MMP-13 activity in the mouse cartilage [J].BMC Musculoskelet Disord, 2013,14:312

中圖分類號：R684.3

文獻標識碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.02.013

*基金項目：廣東省科技計劃項目（編號：2011B031800330）

收稿日期：（2015-10-17）