Pu27下調c-myc基因表達抑制SW480結腸癌細胞增殖

蘭曉瑜 張毅強 王 爽 李美寧 程牛亮（山西醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，山西 太原030001）

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Pu27下調c-myc基因表達抑制SW480結腸癌細胞增殖

蘭曉瑜 張毅強 王 爽 李美寧 程牛亮*
（山西醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，山西 太原030001）

【摘要】目的 探討外源性Pu27序列對SW480結腸癌細胞的作用。方法 設立空白組、Pu27實驗組和MutPu27對照組，觀察藥物攝取，c-myc基因表達，細胞增殖和凋亡情況。 結果 Pu27以非轉染方式進入細胞，下調c-myc基因表達，抑制細胞增殖促進凋亡。 結論 Pu27具有選擇性抗腫瘤作用。

【關鍵詞】pu27；MutPu27；c-myc；結腸癌

G-四鏈體（G-quadruplex）由富含鳥嘌呤核酸序列旋聚而成（圖1），結合和穩定G-四鏈體的藥物抑制端粒酶活性和癌基因表達發揮抗腫瘤作用［1］。癌基因c-myc轉錄的85%～90%由啟動子區核酸超敏元件Ⅲ1（NHEⅢ1）控制，也叫Pu27（圖2），富含鳥嘌呤可形成G-四鏈體沉默基因表達［2-3］。

圖1 G-四鏈體結構圖［3］

圖2 c-myc基因啟動區序列［3］

1 材料與方法

1.1 細胞培養：結腸癌SW480細胞和正常結直腸黏膜FHC細胞，分別用培養基RPMI 1640和DMEM：F12加10%FBS，37 ℃、5% CO2條件下培養，實驗取用對數生長期細胞。

1.2 富鳥氨酸寡核苷酸序列的制備：Pu27 5'-TGGGGAGGGTGGGGA GGGTGGGGAAGG -3'和 MutPu27 5'-TGAGTAGCGTGAGCAGAGTGCG TAACG -3'序列，上海生工生物工程有限公司合成，無 RNAse/DNAse雙蒸水溶解至終濃度200 μmol/L，95 ℃處理5 min備用。

1.3 FITC標記Pu27和MutPu27觀察攝取情況：8 μmol/L 濃度處理SW480細胞，DAPI核染色后觀察。

1.4 MTT法檢測Pu27對細胞的生長抑制作用：1～10 μmol/L濃度梯度處理細胞（1×105cells/well ），5% CO2、37 ℃孵育（24、48、72、144 h），MTT法測490 nm各孔吸光度（OD）值。

1.5 RT-PCR檢測c-myc基因轉錄活性：8 μmol/L 濃度處理細胞6、24、48、72 h，提取總RNA，RT-PCR反應體系參數：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環，72 ℃ 5 min，得出各組CT值。引物序列見表1。

1.6 Western Bolt 檢測c-myc基因蛋白表達：8 μmol/L Pu27和MutPu27，處理SW480細胞6、24、48、72 h提取蛋白，Western Blot 測蛋白表達，計算目的與內參蛋白條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

表1 引物序列

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡：8 μmol/L Pu27和MutPu27處理24、72 h收集細胞，流式細胞儀分析。

1.8 統計學分析：數值用均值±SEM表示，SPSS16.0統計學軟件分析，單因素ANOVA分析MTT法測得數據，LSD法兩兩比較；獨立樣本t檢驗進行不同細胞株間的比較；秩和檢驗分析FCM數據，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Pu27和MutPu27細胞攝取情況：FITC-Pu27處理細胞24h熒光表達最強達87%，72 h后攝取率未見較大降低；FITC-MutPu27細胞攝取率24 h為22%。見圖3。

圖3 SW480細胞Pu27和MutPu27攝取情況

2.2 Pu27抑制結腸癌SW480細胞增殖：8 μmol/L Pu27和MutPu27處理細胞48 h，生長抑制率分別為（0.50±0.03）×100%、（0.11± 0.004）×100%。8 μmol/L Pu27處理FHC和HCT116細胞48 h，生長抑制率分別為（0.08±0.003）×100%、（0.26±0.06）×100%。不同細胞株對Pu27敏感性不同，SW480細胞組高，FHC細胞組低。見圖4。

圖4 A和B.Pu27抑制SW480細胞增殖；C.不同細胞對Pu27的敏感性不同（*所示P＜0.05）

2.3 Pu27抑制c-myc基因表達：8 μmol/L Pu27和MutPu27處理細胞48 h，c-myc mRNA相對表達值分別為（0.48±0.12）×100%、（0.85± 0.08）×100%，蛋白相對表達值為（0.42±0.09）×100%、（0.77± 0.07）×100%。Pu27抑制c-myc基因表達。見圖5。

2.4 Pu27誘導SW480細胞凋亡：Pu27處理細胞48 h，凋亡率為41.34%，MutPu27組、未處理組48 h凋亡率分別為16.34%、6.82%，P＜0.05。見圖6。

圖5 A.Pu27抑制SW480細胞c-myc mRNA表達；B和C.Pu27抑制SW480細胞c-myc蛋白表達（*所示P＜0.05）

圖6 Pu27誘導SW480細胞凋亡

3 討 論

多種穩定c-myc 基因啟動子區四鏈體結構的藥物可以下調c-myc基因表達，表明G-四鏈體結構作為負調節因子在基因轉錄中的作用［2-5］。抑制c- myc基因表達的反義寡核苷酸序列，易被核酸酶降解，細胞攝取率低，對正常細胞有毒性［6］。Pu27抑制c-myc基因表達的同時克服了以上局限，不需轉染易被細胞攝取并穩定存在［7-9］。

本文研究的外源性Pu27抑制SW480細胞增殖誘導凋亡，對正常細胞毒性小，攝取實驗表明Pu27通過非轉染進入細胞，攝取率和穩定性高。MutPu27對比試驗證明，Pu27的生物學作用與連續重復鳥嘌吟序列密切相關。Pu27下調c-myc基因mRNA和蛋白水平。這項研究通過基因組DNA序列選擇性殺死癌細胞，對正常細胞毒性小，作用方式簡單，無需額外輔助，是很有前途的腫瘤治療方案。

參考文獻

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［9］ Islam MA，Thomas SD，Murty VV，et al.c-Myc Quadruplex-forming Sequence Pu-27 Induces Extensive Damage in Both Telomeric and Nontelomeric Regions of DNA［J］.J Biol Chem，2014，289（12）: 8521-8531.

中圖分類號：R735.3+5

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）12-0034-02

*通訊作者：E-mail：chengniuliang@126.com