組織培養技術篩選植物耐鹽突變體的研究進展

鐘琪

摘要 在介紹耐鹽突變體篩選技術的基礎上，綜述了利用組織培養技術篩選植物耐鹽突變體的國內外研究現狀，指出了存在的問題，并對其應用前景進行了展望。

關鍵詞 土壤鹽漬化；組織培養；耐鹽突變體

中圖分類號 Q813.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）05-145-04

Abstract On the basis of introducing screening technology of salt tolerant mutant， research status about screening of plant salt tolerant mutant with tissue culture technology at home and abroad was reviewed， existing problems were pointed out， the future prospect was forecasted.

Key words Soil salinization； Tissue culture； Salt tolerant mutant

據聯合國教科文組織 （UNESCO）和世界糧農組織（FAO）不完全統計，全世界鹽漬土面積約 10億hm2[1]，有100多個國家不同程度地遭受其害[2]。我國鹽漬土面積約3.6×107hm2[3]，土壤鹽漬化嚴重制約農林業生產的發展，破壞了土地資源環境，進一步導致生態環境的惡化，影響了人們正常的生產生活。鹽堿地改良利用可增加糧食產量，改善生態環境，促進經濟和社會的可持續發展。因此，開發利用鹽堿地成為當務之急。

開發利用鹽堿地主要有工程措施和培育耐鹽堿植物品種2種途徑。工程治理需耗費大量人力、物力、財力，加上淡水資源的貧乏，受到了很大限制。而培育耐鹽堿植物品種投資少、見效快，在我國當前經濟條件下成為行之有效的手段而被人們所接受。

雖然通過常規育種途徑選育出一些耐鹽植物品種，但大多缺乏抗鹽種質資源，而非鹽堿條件下的選育使其耐鹽性遺傳變異非常有限，且易丟失。另外，常規育種周期相對較長，難以培育出理想的耐鹽品種。20世紀70年代發展起來的植物組織和細胞培養技術為選育抗鹽植物提供了新的手段。植物組織和細胞培養過程中會發生高頻率的廣泛變異[4]，通過誘變處理能大幅度提高變異的頻率和范圍。另外，因其具有操作方便、可控性強、周期短、成本少等優點而受到國內外學者的重視。筆者在介紹耐鹽突變體篩選技術的基礎上，綜述了利用組織培養技術篩選植物耐鹽突變體的國內外研究現狀，指出了存在的問題，并對其應用前景進行了展望。

1 耐鹽突變體的篩選技術

1.1 建立能夠長期保持高頻率分化能力的無性系

同一植物不同基因型、不同年齡、不同部位以及不同生理狀態的外植體，培養基種類、激素成分與濃度均影響分化頻率，隨著繼代培養次數增加分化頻率逐漸降低。耐鹽突變體篩選需要長期反復繼代培養，因此，能否建立長期保持高頻率再生分化能力的無性系也是該項工作能否成功的重要基礎。隨著組織培養技術的不斷完善和提高，對不同植物，選取不同發育時期的外植體，不同種類的培養基和激素，采用不同的培養方法，誘導出分化頻率較高的愈傷組織，經過多次繼代培養仍具有分化能力。

1.2 篩選耐鹽愈傷組織變異系的方法

建立愈傷組織無性系后，一般采用典型的直接選擇法篩選耐鹽愈傷組織變異系。選擇程序分為一步選擇和多步選擇。2種選擇程序的步驟一般為：從抑制培養基中分離出假定的突變體，通過有鹽無鹽連續幾代培養，清除可能逃脫選擇劑抑制而漏網的野生型細胞和對選擇劑上癮的野生型細胞，從而獲得穩定的耐鹽細胞系。

1.2.1 一步選擇。王侖山等[5]將誘變處理后存活的枸杞下胚軸誘導的愈傷組織轉入含1.5%NaCl的誘導培養基上培養28 d，再將存活的愈傷組織轉入含1.0%NaCl的相同培養基上培養，每21 d轉移一次，共繼代14次，最終獲得耐1.0%NaCl愈傷組織的變異體。李娟等[6]以4個馬鈴薯栽培品種的葉片為外植體采用一步直接篩選法獲得了耐不同濃度NaCl的愈傷組織。戴偉民等[7]以番茄下胚軸為外植體誘導的愈傷組織，將其培養在10 g/L NaCl的選擇培養基上，經過3次繼代篩選得到耐鹽愈傷組織。

1.2.2 多步選擇。王存喜等[8]以中華獼猴桃101品系試管苗葉片為外植體，將誘導出的愈傷組織轉入含NaCl的MS培養基選擇8次，培養基中NaCl濃度逐步增加，γ射線做誘變劑，篩選出耐0.5%、0.7%、1.0%NaCl的變異細胞系。周榮仁等[9]將栽培煙草葉片誘導的愈傷組織采用逐步提高0.5%NaCl的方法，挑選生長良好的愈傷組織繼代培養，獲得了耐0.5%、1.0%、1.5%、2.0%NaCl的細胞系。張亞蘭等[10]以短芒大麥幼穗、幼胚和成熟胚為外植體，建立了胚性懸浮細胞系，以此為材料，結合誘變劑EMS處理，獲得了耐不同濃度NaCl愈傷組織變異體。薛建平等[11]將藥菊葉片誘導出的愈傷組織用0.2%和0.5%EMS分別經浸漬法和滴加法處理，將恢復增殖14 d后存活的愈傷組織逐級轉移至0.5%、1.0%、1.5%NaCl的培養基，每級濃度培養14 d，獲得了耐鹽愈傷組織變異體。毛桂蓮等[12]對枸杞葉片誘導的愈傷組織用不同劑量60Coγ射線處理，將恢復增殖后的愈傷組織，采用逐步提高NaCl濃度的方法，分別接種于含0、0.25%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%NaCl的選擇培養基上，將生長較快的愈傷組織逐級提高NaCl濃度，每21 d轉移一次，最終篩選出耐1.00%NaCl的愈傷組織變異體。還有在紅豆草[13]、玉米[14]、木槿[15]、水稻[16]、沙打旺[17]、紫花苜蓿[18]、小麥[19]等植物中獲得成功的報道。

另外，也有學者對小麥[20]、番茄[21]、大蒜[22]、結縷草[23]采用2種程序同時進行耐鹽愈傷組織變異系篩選的報道。

在篩選耐鹽愈傷組織變異體之前，有學者進行了理化誘變處理，增大了選擇機會，提高了變異頻率，但也有提高變異頻率不明顯的報道[15]。物理誘變劑包括60Co γ射線、X射線、快中子、電子束、激光、微波等，多用于照射種子或外植體。其中離子輻射的誘變頻率高于γ射線，并能誘導多個性狀同時發生變異，具有廣闊的前景。化學誘變劑主要有EMS、抗菌素（平陽霉素、正定霉素）、NaN3等，多用于處理愈傷組織。單純用物理誘變或化學誘變，誘變效果不太理想，誘變范圍較窄，而2種方法結合使用，誘變效果較為理想。誘變劑的使用劑量一般應低于半致死劑量，減少其產生的不良后果，誘變處理后的材料需恢復培養后再進行篩選。因誘變處理可能導致原有的優良性狀消失，產生不良的變異，所以在篩選耐鹽突變體時，應對材料部分進行誘變處理，部分不加處理，最終確定是否需要誘變處理。

1.3 耐鹽愈傷組織變異系的耐鹽性及其耐鹽穩定性的分析

篩選所得的耐鹽愈傷組織變異系是否為變異體必須進行耐鹽性及耐鹽穩定性分析。耐鹽性分析是把對照和在無鹽的誘導培養基上培養多代的耐鹽愈傷組織分別轉入含不同濃度鹽分的繼代培養基上培養一段時間（對照愈傷組織基本停止生長時），以鮮（干）重的相對生長量（相對生長量=[培養一定時間后的鮮（干）重—原鮮（干）重]/原鮮（干）重）表示耐鹽性。在較高選擇壓下，相對生長量較高的愈傷組織可認為是具有耐鹽性的愈傷組織。而耐鹽穩定性分析是把對照和在無鹽誘導培養基上培養多代的耐鹽愈傷組織轉入一定含鹽量的誘導培養基上培養一段時間（對照愈傷組織基本停止生長時），以鮮（干）重的相對生長量（相對生長量=[培養一定時間后的鮮（干）重-原鮮（干）重]/原鮮（干）重）表示，每7 d計算一次相對生長量，相對生長量隨培養時間增加而增加的愈傷組織可認為是耐鹽性穩定的愈傷組織。

王侖山等[5]將對照和在無NaCl的誘導培養基上培養4代的枸杞耐鹽愈傷組織分別轉入含0.25%～1.50%NaCl的誘導培養基培養，21 d后以鮮重的相對生長量[相對生長量=（培養21 d后鮮重-原鮮重）/原鮮重]表示耐鹽性。在不同NaCl濃度下，耐鹽變異體相對生長量均高于對照，說明耐鹽變異體具有耐鹽性。將對照和在無NaCl的誘導培養基上培養4代的枸杞耐鹽愈傷組織轉入含1.0%NaCl的誘導培養基培養，21 d后相對生長量持續增加，說明其耐鹽性穩定。還有對大麥[10]、小麥[24]、菊花[11]進行耐鹽性及耐鹽穩定性分析的研究。

1.4 耐鹽愈傷組織的分化及其再生植株的耐鹽性鑒定

由于耐鹽愈傷組織變異系分化再生植株較難，所以，應建立能長期保持再生分化能力的愈傷組織無性系，另外，還應盡早對耐鹽愈傷組織進行分化培養，一般繼代培養2次即可轉入無鹽或加鹽的分化培養基培養，將分化苗壯苗、移栽，以便在植株水平上進一步篩選鑒定。再生植株的耐鹽性鑒定多用正常條件下愈傷組織分化的植株做對照，將耐鹽再生植株在無鹽條件下培養一段時間后，再轉至一定濃度鹽壓下生長，分別計算植株各個性狀的耐鹽系數和耐鹽指數，確定耐鹽級別。還可以測定植株葉片中K+、Na+等離子含量，游離脯氨酸含量，可溶性糖含量，相對電導率等生理生化指標。經過鑒定為耐鹽植株的，將獲得的種子加以繁殖，或取后代植株的葉片、莖段等作為外植體，對其進行鹽脅迫處理，有性繁殖后代具有耐鹽性的，可認為是耐鹽突變體。

2 國內外研究現狀

2.1 再生植株的耐鹽性能通過有性繁殖遺傳給后代

Nabors等[25]通過9次增加NaCl濃度的多次選擇法，于1975年獲得了第一個煙草耐鹽細胞系，并分化出耐鹽植株，其連續自交兩代后能穩定地耐受海水的灌溉，這也是首例通過有性繁殖將耐鹽性遺傳給后代的報道。Zenk[26]用組織培養技術首次成功地篩選出耐1%NaCl的野生煙草耐鹽細胞系，在含鹽培養基上培養多代仍保持穩定的耐鹽性。Oono[27]用水稻種子誘導的愈傷組織直接培養在含1%NaCl的培養基中，得到了高頻率的耐鹽突變體植株，其后代也具有耐鹽性。鄭企成等[19]用含0.4%NaCl的培養基誘導冬小麥幼穗愈傷組織，在相同條件下繼代1年后，以0.4%NaCl為一梯度，逐級升高選擇濃度至2.0%。分化再生后獲得21株植株，其中18株獲得了種子，部分后代具有一定的耐鹽性。米海莉等[28]用小麥成熟胚誘導產生胚性愈傷組織，采用恒定濃度篩選法和逐級篩選法進行耐鹽突變體的篩選，將經過0.5%NaCl繼代培養存活的愈傷組織轉入相同含鹽量的分化培養基上再生出植株，將再生植株后代種子播種到大田鹽地，收獲的種子加鹽水培，得到了耐鹽性幼苗。鄭霞等[29]以玉米幼胚誘導出愈傷組織，采用多步選擇法，在濃度為10～20 mg/L NaCl的N6選擇培養基上連續選擇3代，得到耐20 mg/L NaCl的愈傷組織變異體，進一步在分化培養基上分化出再生植株，其自交后代種子也具有耐鹽性。還有在小麥[30-31]、番茄[32]中獲得成功的報道。

2.2 分化得到耐鹽再生植株，但其后代不耐鹽或無后代

王侖山等[5]將枸杞無菌苗下胚軸誘導產生的胚性愈傷組織經0.34%EMS處理后，將存活愈傷組織轉至1.5%NaCl培養基培養，再將存活組織轉至含1.0%NaCl的相同培養基，篩選出耐1.0%NaCl的愈傷組織變異體，少數變異體在1.0%NaCl培養基分化出耐鹽再生植株。周榮仁等[9]以煙草葉片為外植體，通過逐漸增加NaCl濃度的方法，獲得耐2.0%NaCl的愈傷組織變異體，但耐2.0%NaCl的愈傷組織在2.0%NaCl的培養基中繼代29次后再轉入無鹽培養基培養11和20代后不能保持2.0%NaCl水平的耐鹽性，分別退化至耐1.5%和1.0%NaCl水平。耐2.0%NaCl的愈傷組織分化的植株，其自交后代的種子、幼苗、植株均未表現出耐鹽性。馮桂苓等[16]采用逐漸增加NaCl濃度多次繼代篩選法對水稻F2代成熟胚愈傷組織進行耐鹽突變體篩選，最終獲得了能在0.3%NaCl土壤中正常生長的4株耐鹽株系。梁小紅等[23]采用高鹽直接篩選和逐步提高鹽濃度篩選，對結縷草成熟胚進行耐鹽愈傷組織篩選，將獲得的生長旺盛的耐鹽愈傷組織轉入高鹽分化培養基中，2種篩選方法獲得了15個耐1.0%NaCl的株系和14個耐1.2%NaCl的株系。王興軍等[33]以成熟去皮的木槿種子誘導的無菌苗下胚軸為外植體誘導出愈傷組織，用逐步提高NaCl濃度的方法，獲得了耐鹽性穩定的細胞系，耐鹽細胞系經分化培養獲得了再生植株，再生植株具有耐鹽性。另外，還有對小麥[34]、紅豆草[35]、玉米[36]進行相關研究的報道。

2.3 得到耐鹽愈傷組織，未獲得耐鹽再生植株

毛桂蓮等[12]以枸杞葉片為外植體誘導出的愈傷組織用不同劑量的60Co γ射線進行照射，將恢復增殖的愈傷組織采用逐步提高含鹽量的方法，獲得了穩定的耐1.0% NaCl的愈傷組織變異體。岳瑋等[37]將獐毛匍匐莖莖尖、子房、胚珠等為來源的原始型愈傷組織培養在2.0%NaCl的培養基上連續篩選，獲得了耐2.0%NaCl的變異型愈傷組織，其在無NaCl培養基中長期培養后仍能耐2.0%NaCl。

2.4 其他

在鹽脅迫過程中培養的植物組織或細胞會合成新的蛋白質，在沙打旺[17]、水稻[38]、小麥[39]等植物的培養組織或再生植株中發現了此種鹽脅迫蛋白，進行了一些鹽脅迫蛋白的亞細胞定位，某些酶的鹽誘導合成和26 ku鹽脅迫蛋白的分離、純化、氨基酸順序分析等研究。

研究者還對細胞和植株水平上耐鹽突變體的K+、Na+、Cl-等離子吸收與耐鹽性的關系進行了研究[37，40]，發現細胞中Na+濃度與耐鹽性呈正相關，K+濃度與Na+濃度呈負相關。

在耐鹽突變體篩選中研究較多的小分子有機物是脯氨酸，它是滲透脅迫過程中容易累積的一種氨基酸。研究證明，在鹽脅迫過程中，細胞內游離脯氨酸的含量顯著增加。如毫菊耐鹽愈傷組織變異體在0.5%和1.0% NaCl脅迫下，游離脯氨酸含量急劇增加，分別是對照的14.2倍和48.9倍，在1.5%NaCl脅迫下，游離脯氨酸含量有所下降，但仍是對照的42.0倍[11]。在枸杞[5]、煙草[9]、獐毛[37]等植物中也有游離脯氨酸含量增加的報道。而在木槿耐鹽細胞中，脯氨酸含量增加不顯著[33]，與上述試驗結果有所不同。而脯氨酸的積累與耐鹽性的關系也一直存在爭論，但脯氨酸的積累究竟是鹽脅迫引起植物損傷的結果， 還是耐鹽脅迫的原因， 目前尚不清楚。有學者認為脯氨酸的積累是耐鹽的原因， 而不是鹽脅迫的結果。Van Swaaij等[41]建立的土豆無性系在無鹽脅迫條件下也能積累大量脯氨酸，其中有些細胞系確實具有較強的耐鹽能力， 表明大量脯氨酸的積累可能具有對抗鹽害的功能。而有學者認為脯氨酸的積累是鹽脅迫的偶然性結果，如大豆在同樣鹽脅迫條件下，脯氨酸的積累是一種栽培特性，其含量與抗鹽脅迫能力無相關性[42]。對高粱的研究發現，耐鹽性與脯氨酸的積累也無相關性[43]。因此，脯氨酸的積累與耐鹽性的關系有待深入研究。

酶是基因的產物，也是遺傳學研究的重要手段，通過同工酶種類的變化，能了解基因產物的表達。對耐鹽突變體同工酶、全蛋白變化的研究發現，耐鹽植物的同工酶譜帶與對照差異顯著[38，44]，耐鹽植物能產生特異表達蛋白[45]。

通過測定耐鹽變異體Na+、K+等離子含量、脯氨酸含量和同工酶譜帶等生理生化指標還不能充分說明它們發生了遺傳變異，缺少分子水平的證據，而DNA分子遺傳標記彌補了上述不足。目前多采用RFLP、AFLP、RAPD等標記進行耐鹽突變體的分子鑒定，已成功在分子水平上鑒定的耐鹽突變體有水稻[46]、小麥[47]、小黑麥[48]、豆瓣菜[49]、蘆葦[50]、大豆和苜蓿[51]等。

利用組織培養技術篩選植物耐鹽突變體，草本植物研究較多，木本植物研究較少，其中楊樹研究較多，其他樹種研究較少。目前已對不同楊樹品種[52-58]、中華獼猴桃[8]、木槿[15，33]、櫻桃[59]、柑橘[60]、蘋果砧木[61]進行耐鹽突變體篩選方面的研究。

3 問題與展望

目前，篩選耐鹽突變體的研究取得了一些進展，但也存在諸多問題，尚需進一步探索和研究。

所得到的大多數愈傷組織或細胞系的耐鹽性和再生植株的耐鹽性并不一致或只是部分相關，即愈傷組織或細胞系表達的基因在其再生植株中不一定能表達。植物的耐鹽性是十分復雜的數量性狀，是多性狀的綜合表現，受到多基因控制，基因表達的數目和程度在植株與細胞2種水平上可能有些差異，使得2種水平的耐鹽性不完全一致。也有些植物如小麥、番茄等在2種水平的耐鹽性一致，此類植物容易從細胞水平篩選耐鹽品系。

由于長期繼代培養，耐鹽細胞系表現出明顯的鹽毒害作用，嚴重喪失分化能力，難已分化再生植株，即便分化，植株也多為畸形，移栽至土壤中成活率極低，而存活下來的也多為不育植株，難以獲得種子。因此，篩選耐鹽突變體應建立能長期保持高頻率再生分化能力的無性系，不斷完善耐鹽篩選的程序，使耐鹽細胞系在長期選擇后仍具有較高的再生分化能力。

篩選耐鹽突變體過程中，利用離體培養的器官、組織等材料進行誘變處理會出現嵌合體，為突變體篩選和鑒定增加了難度，且突變頻率很低，影響篩選效率，而利用懸浮細胞可以很好地解決此問題，但懸浮培養技術難度大，需加強該方面的研究。

當前篩選耐鹽突變體只是針對耐鹽性狀的研究，很少考慮到育性、品質、產量等方面性狀，隨著科學技術的不斷進步，將耐鹽突變體育種同常規育種和基因工程的手段相結合，以期培育出耐鹽堿、優質、豐產的優良品種，更好地為農林業生產發展服務。

我國具有大面積以碳酸鹽、硫酸鹽以及混合鹽為主的鹽漬土，目前研究多是以NaCl為選擇劑篩選耐鹽突變體，即使獲得了耐鹽植株，其是否能在其他類型鹽漬土上長期正常生長尚未知，所以應開展耐其他類型鹽分突變體篩選的研究。

作為對保護和改善生態環境具有重要意義的林木，利用組織和細胞培養技術對其進行耐鹽突變體篩選研究較少，可嘗試應用此技術進行耐鹽突變體篩選的研究，以期篩選出耐鹽堿的林木。

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