PM2.5對肝細胞脂質代謝和氧化應激的影響

李明++++++謝菁菁++++++吳彤++++++王嬰++++++劉方芳++++++王芳++++++李巖

[摘要] 目的 探討大氣細顆粒物PM2.5對肝細胞脂質代謝和氧化應激的影響。 方法 收集2014年廣州城區大氣中的PM2.5，以CCK-8法分析6.25～100 μg/ml的PM2.5對肝L02細胞的毒性。根據PM2.5濃度分別設立6.25 μg/ml組、12.50 μg/ml組和25.00 μg/ml組，同時設立陰性對照組，比較各組細胞內三酰甘油和膽固醇含量、肝X受體α（LXRα）和固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）的表達水平及氧自由基水平。 結果 PM2.5濃度為50.00 μg/ml時，對肝L02細胞有明顯毒性。各劑量組肝細胞內的三酰甘油濃度顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。25.00 μg/ml組的LXRα和SREBP-1c表達水平顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。各劑量組的氧自由基水平顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。 結論 PM2.5可通過LXRα和SREBP-1c誘導肝細胞脂質堆積，并誘發肝細胞氧化應激，這可能是PM2.5引起非酒精性脂肪肝的重要機制。

[關鍵詞] PM2.5；肝細胞；脂質代謝；氧化應激

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（c）-0009-03

[Abstract] Objective To explore the influence of PM2.5 on lipid metabolism and oxidative stress of hepatocyte. Methods PM2.5 was collected from atmosphere in urban area of Guangzhou in 2014.Toxicity of liver L02 cell was analyzed by CCK-8 at PM2.5 levels of 6.25-100 μg/ml.The group of 6.25 μg/ml，12.5 μg/ml，25 μg/ml was set respectively，and the negative control group was set.The contents of intracellular triglyceride and cholesterol，the expression level of LXRα and SREBP-1c，the intracellular oxygen free radical level among four groups was compared. Results When the PM2.5 concentration was 50 g/ml，which had obvious toxicity to liver L02 cells.The concentration of triacylglycerol in the liver cells in each dose group was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.05）.The expression level of LXRα and SREBP-1c in the group of 25.00 g/ml was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.01）.The level of oxyradical in each dose group was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.01）. Conclusion PM2.5 can induce lipid accumulation in hepatocytes via LXRα and SREBP-1c，and induce oxidative stress in hepatocytes，which may be the important mechanism of PM2.5 causing non-alcoholic fatty liver disease.

[Key words] PM2.5；Hepatocyte；Lipid metabolism；Oxidative stress

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除酒精及其他明確肝損傷因素之外造成的，以肝臟脂肪沉積和肝細胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征[1]。近年來的流行病學研究顯示，PM2.5與NAFLD的發生、發展密切相關[2-3]。目前，關于PM2.5在NAFLD中的作用，尤其是PM2.5對肝細胞的影響并不清楚。本研究通過培養人肝細胞L02株，觀察PM2.5對肝臟細胞脂肪含量和氧化應激的影響，從肝細胞脂質合成關鍵蛋白肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）和固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）的表達變化探討PM2.5引起肝細胞脂肪堆積的原因。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

CCK-8試劑盒（日本同仁公司），Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司），DCFH-DA（美國Lifescience公司），三酰甘油和總膽固醇檢測試劑盒（南京建成生物有限公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司），定量PCR儀器（美國Bio-Rad公司）。參照本室所建立的方法于2014年在廣州城區采集大氣中的PM2.5，采用無血清DMEM培養基配制成一定濃度-80℃保存備用[4]。

1.2 指標與方法

1.2.1 CCK-8法檢測PM2.5對肝細胞的毒性 取對數生長期的L02細胞，加入96孔板中，以終濃度6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/ml的PM2.5對肝細胞染毒，另設陰性對照組，每組設6個復孔，36 h后按說明書步驟測定細胞吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100%。

1.2.2 胞內脂質含量測定 根據CCK-8結果選取6.25、12.50和25.00 μg/ml三個濃度的PM2.5對L02細胞染毒，另設陰性對照組。36 h后收集細胞，PBS洗滌兩次，取細胞裂解液，按說明書檢測總膽固醇和三酰甘油的濃度。

1.2.3 LXRα和SREBP-1c基因表達檢測 同步驟1.2.2分組和染毒，提取總RNA，按說明書用定量PCR檢測兩者的表達。LXRα上游引物：5′-TCA GAG AGG AAG CCA GGA TG-3′，下游引物：ACG GAT CTC TGT GGG TTC TG；SREBP-1c；上游引物：5′-CGA CAT CGA AGA CAT GCT TCA G-3′，下游引物：5′-GGA AGG CTT CAA GAG AGG AGC-3′；β-actin上游引物：5′-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A-3′，下游引物：5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3′。PCR條件為95℃預變性30 s，然后95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個循環。目的基因的表達水平采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.4 胞內ROS水平檢測 同步驟1.2.2分組和染毒，4 h后用PBS漂洗2次，按說明書步驟以DCFH-DA熒光染料（5μm）標記胞內的氧自由基，30 min后用酶標儀進行測定。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5對L02細胞的毒性分析

PM2.5濃度為50.00 μg/ml時，對肝L02細胞有明顯的毒性，細胞存活率為（80.44±6.42）%，與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。當PM2.5濃度<25.00 μg/ml時，L02細胞生長雖然部分受到抑制，但與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），因此，本研究選用6.25、12.50和25.00 μg/ml作為后繼實驗中PM2.5的終濃度。

2.2 PM2.5對肝細胞胞內脂質含量的影響

PM2.5處理后，肝細胞內三酰甘油濃度明顯增高，與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。細胞內總膽固醇含量與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1），提示PM2.5使肝細胞內三酰甘油含量增高，進而誘導肝細胞脂肪變。

2.3 PM2.5對LXRα、SREBP-1c表達的影響

各劑量組的LXRα和SREBP-1c表達水平顯著增高。25.00 μg/ml組的LXRα和SREBP-1c表達水平分別為陰性對照組的（1.29±016）倍和（1.89±0.21）倍，差異有統計學意義（P<0.01）（圖1），提示PM2.5可以上調兩者的表達，這可能是PM2.5引起肝細胞內三酰甘油含量增高的原因之一。

2.4 PM2.5對L02細胞氧自由基生成的影響

PM2.5刺激后，各劑量組肝L02細胞內有大量ROS形成，熒光強度分別是陰性對照組的（153.37±12.35）%、（134.05%±10.30）%和（143.83%±10.08）%，差異有統計學意義（P<0.01），提示PM2.5可以引起肝細胞的氧化應激，導致細胞內氧自由基生成增多。

3 討論

近年來的流行病學研究顯示，NAFLD在我國城市人口中的患病率已達到或超過某些西方國家的水平[5]。除嚴重影響肝臟功能外，NAFLD還與代謝綜合征、動脈粥樣硬化等重大疾病密切相關，因此，其被認為是一種危害全身健康的肝臟疾病[1]。“二次打擊”學說是關于NAFLD發病的經典學說，認為脂類在肝細胞內的聚集是NAFLD發生中的第一次打擊，在此基礎上各種肝毒性物質刺激肝細胞和庫普弗細胞活化，引起氧化應激，促使局部肝細胞發生炎性反應、脂質過氧化和細胞損傷，形成第二次打擊，導致NAFLD的發生[6]。

PM是大氣中所有顆粒物的總稱，其中影響人類健康的主要是空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物PM2.5。研究顯示，PM2.5可直接進入血液循環，影響全身多個組織器官的功能[7]。最近的流行病學調查顯示，PM2.5與NAFLD的發病率呈正相關[8-9]。動物實驗研究結果顯示，PM2.5吸入可使小鼠肝臟組織出現脂肪變[10-11]。這些研究雖然證實了PM2.5與NAFLD關系密切，但并未對PM2.5影響NAFLD的機制進行探討。本研究結果顯示，PM2.5處理后肝細胞三酰甘油含量明顯增高，提示PM2.5可以促進NAFLD發病機制中的第一次打擊。LXRα和SREBP-1c是脂肪酸合成的關鍵性分子[12-13]，本實驗結果顯示，PM2.5可使L02細胞LXRα和SREBP-1c表達明顯增高，提示其可能是PM2.5引起肝細胞脂肪含量增多的機制之一。

氧化應激是造成NAFLD第二次打擊的主要原因[14]。NAFLD大鼠肝臟組織中的氧自由基水平遠高于正常大鼠，給予抗氧化藥物后則可明顯改善NAFLD的病變程度，提示氧化應激在其中具有關鍵作用[15]。本實驗結果顯示，PM2.5染毒導致肝細胞生成大量的氧自由基，與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01），提示PM2.5還可通過影響NAFLD發生中的第二次打擊來引起肝細胞損傷。

綜上所述，PM2.5染毒導致肝細胞內脂質和氧自由基增多，這可能是其引起NAFLD的原因。此外，LXRα和SREBP-1c表達上調與PM2.5促進肝細胞脂質合成有關。

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（收稿日期：2015-11-23 本文編輯：祁海文）