蘭州方對再生障礙性貧血模型小鼠淋巴細胞亞群和脾臟組織的影響*

黃邦榮，展　銳，倪　紅，楊佳華，王蘭英，張永萍，梁　曦

(甘肅省中醫院腫瘤血液科，甘肅 蘭州 730050)

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·實驗研究·

蘭州方對再生障礙性貧血模型小鼠淋巴細胞亞群和脾臟組織的影響*

黃邦榮，展銳，倪紅，楊佳華，王蘭英，張永萍，梁曦

(甘肅省中醫院腫瘤血液科，甘肅 蘭州 730050)

摘要目的：觀察蘭州方對再生障礙性貧血模型小鼠淋巴細胞亞群和脾臟組織的影響。方法：將90只BALB/C小鼠，隨機分為蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒組，模型對照組和正常對照組，每組15只。造模成功后第8天起，蘭州方大、中、小劑量組分別予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)藥液(當于成人用量的40,20,10倍)灌胃；貞芪扶正顆粒組予以0.01 g/(g·d)(相當于成人臨床用量的20倍)灌胃；正常對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，連續40 d。脫頸處死小鼠，無菌條件下剖腹取出脾臟，采用免疫組化法測CD4+、CD8+含量及CD4+/CD8+的值，并觀察各組脾臟病理組織學變化。結果：蘭州方能使脾臟CD4+含量呈增高趨勢、CD8+含量呈降低趨勢，同時提高CD4+/CD8+值；蘭州方可減輕模型小鼠脾臟病理學改變，明顯降低脾臟淋巴細胞的凋亡率, 促進生發中心恢復。結論：蘭州方能調節機體紊亂的免疫狀態，提高CD4+、降低CD8+的數量和活性,調整CD4+/CD8+值,對再障小鼠脾臟組織有顯著改善作用。

關鍵詞再生障礙性貧血； 蘭州方； 淋巴細胞亞群；脾臟組織；動物；小鼠

再生障礙性貧血屬中醫學“血虛”“血證”“虛勞”“虛損”及“血枯”等范疇。中醫學認為：血與氣、血與精的關系密切。氣屬陽，血屬陰，血液的生成有賴于氣，氣可生血，血可化氣，精血互化。精系生命之根本，閉藏于腎中，腎精生髓，精髓能化生血液。全國著名中西醫結合專家裴正學教授認為:健脾補腎是治療再生障礙性貧血的根本大法。蘭州方是在此理論基礎上根據多年臨床經驗研制而成，具有補腎生髓、健脾益氣、養血和胃功效，臨床治療再生障礙性貧血、調整機體免疫功能收效良好。為進一步研究中醫健脾補腎理論治療再障的作用機制，本研究觀察了蘭州方對再障模型小鼠淋巴細胞亞群和脾臟組織的影響。

1材料與方法

1.1動物

健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，體質量(20±2g), 8～10周齡，DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周齡[1]，由甘肅省醫學科學研究院實驗動物中心提供，動物合格證號：醫動字第14-009號。

1.2藥品與儀器

蘭州方由生地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、北沙參、人參須、潞黨參、太子參、桂枝、浮小麥、大棗、麥冬、五味子、炙甘草、白芍、墓頭回等組成，由甘肅省蘭州市薈萃堂制成顆粒沖劑，每包含生藥量36.25 g；貞芪扶正顆粒，由佛慈制藥有限公司提供，生產批號 Z62020416。 直線加速器，德國西門子Primus產品；VS-1300L型超凈工作臺，蘇凈集團 蘇州安泰空氣技術有限責任公司產品；BCD-213型低溫冰箱，青島海爾股份有限公司產品；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘處理儀、CM1900HE染色儀、BMJ-Ⅲ型包埋機，均為常州中威電子儀器廠產品；BP211D型電子天平，瑞士Sartorius公司產品。

1.3腺淋巴結細胞懸液制備

取DBA/2小鼠斷頸處死，用750 mL/L酒精浸泡5 min，常規消毒；無菌下取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結；加少量生理鹽水，輕輕剪碎、碾碎，用200目尼龍網過濾；通過4#針頭使其成單細胞懸液；臺盼藍鑒定細胞活性，活性細胞達95%以上[2]。

1.4分組與模型的建立

將動物隨機分為正常對照組，模型對照組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒組，每組15只。

造模方法參照姚軍等[3]再障造模和趙忻等[4]關于免疫介導小鼠再障模型方法改進。除正常對照組外，將其余75只BALB/C小鼠經直線加速器6Mv γ射線全身照射，照射高度100 cm，時間1 min，劑量3.0GY。照射4 h內經尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴結細胞懸液0.2 mL，細胞數1×106/只[5]。造模1周后，血常規、骨髓涂片檢測造模是否成功。血常規：經尾靜脈采血，結果示模型組與正常對照組對比,白細胞、血小板、血紅蛋白均明顯下降(P<0.01),見表1。 骨髓涂片：每組隨機取5只小鼠，脫頸處死后取出左側股骨,用4號針頭取1 mL RPMI-1640液沖出骨髓,滴于載玻片上推片，HE染色,在光學顯微鏡下進行骨髓組織形態學觀察[6]。結果顯示造模組小鼠骨髓增生低下，粒系平均<15%、紅系<7%、巨核細胞0～7個/HP；正常對照組骨髓增生活躍，粒系平均>40%、紅系平均>14%、巨核細胞45～72個/HP；兩組對比，差別有統計學意義(P<0.05)。以上結果證實:本實驗所復制的免疫介導型再障小鼠模型是成功的[7]，可以按原方案進行后期實驗。

注：與正常對照組對比，*P<0.05,**P<0.01。

1.5給藥方法

造模成功后第8天起，各組開始灌胃。蘭州方顆粒、貞芪扶正顆粒臨用前分別用蒸餾水充分溶解，根據文獻中人/小鼠用藥等效劑量換算法，中藥中劑量組相當于成人臨床用量的20倍[8]。蘭州方大、中、小劑量組分別予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)藥液(相當于成人用量的40,20,10倍)灌胃,貞芪扶正顆粒組每只0.01 g/(g·d)(相當于成人臨床用量的20倍)灌胃，正常對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，連續40 d[9]。灌胃期間，各組均以普通飼料喂養。

1.6檢測指標

1.6.1T淋巴細胞亞群測定

參照文獻[10]方法進行。免疫組化染色步驟[11]如下：① 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS液(pH值7.5±0.1)沖洗3次，每次3 min； ② 根據單克隆抗體的要求，加1 mL EDTA修復液(pH值8.0)，對組織抗原進行修復；③ 每張切片加1滴過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS液沖洗3次，每次3 min；④ 除去PBS液，每張切片加1滴正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min；⑤ 除去動物血清，每張切片加第一抗體，室溫下孵育60 min；⑥ PBS液沖洗3次，每次5 min，除去PBS液，每張切片加1滴生物素標記的第二抗體KT-9707-c，Biotin-conjugated second Antibody(Rabbit)，室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次，每次3 min；⑦ 除去PBS液，每張切片加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑧ 除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，鏡下觀察3～10 min；⑨ 自來水沖洗，蘇木素復染，PBS液沖洗返藍；⑩ DAB顯色，所有切片經過梯度酒精逐級脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。過氧化物酶-抗過氧化物酶法，最終反應產物呈棕色，切片經圖像分析軟件處理后，根據平均光密度值及目標面積比得出陽性細胞所占百分數。

1.6.2脾臟組織病理學變化

灌胃結束，脫頸處死小鼠；無菌條件下剖腹取出脾臟，用40 g/L甲醛溶液固定；用體積分數遞減的無水乙醇逐級脫水干燥，二甲苯透明，石蠟包埋,將每份標本制成4 μm厚度的組織切片，每例標本連續切制3片；脫蠟后分別進行HE染色；在光學顯微鏡下進行脾臟形態學觀察。

1.7統計學方法

2結果

2.1各組小鼠T淋巴細胞亞群含量對比

與正常對照組對比，模型對照組小鼠CD4+值下降，CD8+值升高，CD4+/CD8+降低,差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，蘭州方中、小劑量組的CD4+值升高，CD8+值降低，差別有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；而蘭州方大劑量組、貞芪扶正顆粒組CD4+升高、CD8+降低作用不顯著，CD4+/CD8+僅略升高，差別無統計學意義(P>0.05)。見表2。

注:與正常對照組對比，*P>0.05,**P<0.05，***P<0.01；與模型對照組對比，#P>0.05， ##P<0.05，###P<0.01。

2.2各組小鼠脾臟組織病理學情況對比

模型對照組脾臟體積縮小,質量減輕,色淡紅,脾被膜增厚,切片未見髓外造血, 脾小體萎縮,數目減少,脾組織結構疏松,脾血竇擴張,但不充血,呈貧血狀,部分區域可見脾小動脈壁增厚及玻璃樣變。蘭州方中劑量組白髓面積可占50%～70%，生發中心恢復良好，擴張的血竇基本恢復正常，呈充血狀態。小劑量組和貞芪扶正顆粒組白髓面積、脾小體數量、生發中心、被膜和血竇均不同程度恢復。大劑量組則恢復較慢，僅比模型對照組略優。小鼠脾臟病理切片見圖1～12。

3討論

大量研究表明，再障患者存在T淋巴細胞亞群失衡。CD8+細胞異常激活,導致抑制性細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等分泌異常增多[12]，協同對造血起負調控作用，導致造血干和(或)祖細胞增殖、分化缺陷[13]。IL-2、TNF-α、IFN-γ 等細胞因子不僅能直接抑制造血細胞的增殖[14]，而且還可通過Fas抗原(CD95)介導的細胞凋亡，誘導CD34細胞的程序性死亡，從而導致造血衰竭[15]。

本研究表明，蘭州方可使再障模型小鼠脾臟CD4+含量呈增高趨勢、CD8+含量呈降低趨勢，同時調整CD4+/CD8+值，具有免疫調節作用。小鼠脾臟病理組織切片觀察表明，蘭州方可減輕再障模型小鼠脾臟病理學改變，降低淋巴細胞的凋亡率，促進生發中心的恢復，使白髓面積擴大，被膜變薄，擴張的血竇基本恢復正常。蘭州方大劑量組作用不明顯，考慮與中藥劑量過大，超過小鼠胃腸之負荷，導致一系列功能紊亂，同時中藥劑量過大亦會產生一定毒副作用，提示我們在臨床用藥時應把握中藥的劑量，尤其對小兒患者，更應謹慎用藥。

4參考文獻

[1]苗明三.實驗動物和動物實驗技術[M].北京：中國中醫藥出版社，1997,142.

[2]周永明,程軍,薛志忠,等.生血合劑及其拆方對免疫介導再生障礙性貧血小鼠作用的實驗研究[J].上海中醫藥大學學報，2002,16(1):56-59.

[3]姚軍，李樹濃.淋巴細胞與再生障礙性貧血關系的實驗研究[J].中華血液學雜志，1991,12(5):229-231.

[4]趙忻,汪明春,廖繼東,等.免疫介導小鼠再障模型方法的改進[J].中國病理生理雜志，2002,18(6):716-717.

[5]孫紀元,王四旺,謝艷華,等.再生障礙性貧血的動物模型實驗研究[J].中國實驗動物學雜志,2000,4(10):211-212.

[6]浦權,李世俊,楊梅如.骨髓活檢病理學[M].哈爾濱:黑龍江科學技術出版社,1993:59-62.

[7]丁敬遠,黃振翹,周永明,等.補腎方藥對免疫介導再生障礙性貧血小鼠IL-3、IFN-γ的影響[J].上海中醫藥大學學報， 2003,17(3)：53-55.

[8]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].上海:上海科學技術出版社,1991:36.

[9]邱仲川,趙琳,陳佩.補腎復方沖劑對免疫介導再障小鼠作用機制的實驗研究[J].臨床血液學雜志,2002,15(5):221.

[10]龍振山,丁桂風.免疫學實驗技術[M].上海:上海科學技術出版社,1990:130.

[11]李滌生.臨床檢驗基礎[M].北京:人民衛生出版社,1991:38，94-95.

[12]黃韜,黃振翹,周永明,等.補腎瀉肝方治療再生障礙性貧血臨床療效與IFN-γ mRNA基因表達關系的研究[J].現代中西醫結合雜志,2001,10(19):1823-1825.

[13]后盾.右歸丸加味對慢性重型再生障礙性貧血患者免疫學指標變化的影響[J].中國中醫藥科技，1998,5(6):379.

[14]王欣,張明瑛,宋素琴,等.再生障礙性貧血患者細胞免疫功能與造血細胞因子的研究[J].中華血液雜志，1998,19(4):181.

[15]Maciejewski JP,Selleri C,young NS.Fas antigen expression on CD34+human marrow cells is induced by interferon- gamma supression in vitro[J].Blood，1995,85(11):3183-3190.

(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)01-0054-05

中圖分類號:R556.5

文獻標志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.25

作者簡介

黃邦榮(1979—)，男(漢族)，甘肅民勤人，碩士，副主任醫師，主要從事腫瘤及血液病的中西醫結合診療工作。

* 基金項目：甘肅省中醫藥科學技術研究課題(GZK-2012-23)

收稿日期：2015-02-08；修回日期：2015-09-09