熱補針法對RA模型家兔關節滑膜LDH、ATPase活性的影響*

杜小正,王金海,秦曉光,方曉麗,張小江

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000)

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·實驗研究·

熱補針法對RA模型家兔關節滑膜LDH、ATPase活性的影響*

杜小正1,王金海2,秦曉光1,方曉麗1,張小江1

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：從機體能量代謝的角度探討熱補針法“取熱”的作用機制。方法：將40只青紫藍家兔隨機分為正常對照組、模型對照組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組，每組8只。除正常對照組外，采用卵蛋白誘導法和低溫冷凍法對其他4組進行RA寒證模型復制。造模成功后，除正常對照組、模型對照組外，其余各組分別施以平補平瀉、捻轉補法、熱補針法針刺，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。治療結束后分離關節滑膜，冰凍切片，借助組織化學染色技術觀察膝關節滑膜組織乳酸脫氫酶(LDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)活性。結果：模型對照組LDH和ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比高于正常對照組，差別有統計學意義(P<0.05)；針刺組LDH活性變化均低于模型對照組(P<0.05)，而ATPase活性變化均高于模型對照組(P<0.05)；熱補針法組LDH活性變化均低于其他兩針刺組(P<0.05)，但ATPase活性變化明顯高于其他兩針刺組(P<0.05)。結論: 熱補針法能夠降低RA家兔關節滑膜LDH活性，增強ATPase活性，從而增強有氧代謝，使機體局部產生更多的能量可能是熱補針法“取熱”的機制之一。

關鍵詞熱補針法；類風濕關節炎；LDH；ATPase；動物；家兔

熱補針法是簡化燒山火和進火補法所形成的一種針刺手法，具有溫陽散寒的作用，能使患者產生熱感[1]。研究[2-4]表明：類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)患者存在能量代謝不足的現象，即輕中度貧血、四肢關節冰冷僵硬等。前期的研究[5-8]證實了熱補針法對RA模型家兔具有鎮痛效應，并且證實與腦脊液中β-EP、CCK-8和關節局部組織中β-EP、PGE2和LEK的變化有關。但是，這些研究只是從某些微觀指標闡釋了其機理，未能體現熱補針法“取熱”的特點，還不足以揭示熱補針法對RA的相對特異調節機制。作為一種“取熱”手法，是否調節了RA機體能量代謝，顯示出相對特異性的治療作用？因此，本實驗以RA寒證模型家兔為載體，觀察熱補針法對能量代謝相關酶LDH和ATPase的影響，從調節機體能量代謝的角度探討其作用機制。

1材料與方法

1.1動物

健康2.5月齡普通級雄性青紫藍家兔40只，體質量(2.5±0.5)kg，由蘭州生物制品研究所提供，合格證號SCXK(甘)2012-0001。動物購回后在蘭州軍區總醫院實驗動物中心(許可證號SYXK2007-007)飼養，飼養環境為：溫度(20±2)℃，相對濕度(50±10)%，按晝夜節律自然照明，自由進食和飲水(自來水)，每周稱量1次體質量。

1.2試劑與儀器

弗氏完全佐劑，Sigma公司產品，批號120428；卵蛋白干粉，上海伯奧生物科技有限公司產品，批號120513；硫化鈉，上海化學試劑二廠產品，批號120511；LDH、ATPase染色試劑盒，上海榕柏生物技術有限公司產品，批號20120569。華佗牌針灸針，直徑0.25 mm、長40 mm，蘇州醫療用品有限公司產品；HANGPINGJAZO03精密天平，上海精密儀器公司產品；Tissue-Tek TEC全自動組織包埋機，產地日本；CM1900冰凍切片機，產地德國、OLYMPUS 51TR-32FB3-E01光學顯微鏡，產地日本。

1.3分組與模型的建立

動物被適應性飼養7d后，隨機分為正常對照組、模型對照組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組，每組8只。以卵蛋白誘導法和低溫冷凍法進行類風濕性關節炎寒證模型復制[9-10]，即：在實驗開始的前3 d，用硫化鈉和蒸餾水配制成的80 g/L硫化鈉作為脫毛劑，脫掉家兔肩背部提前選定的6個點和雙后腿膝關節周圍的毛。將4 g/L的卵蛋白溶液和等量的弗氏完全佐劑混合液于每個點皮下注射0.2 mL。兩周后再以同樣的方法、劑量每點重復皮下注射1次。第2次免疫完成后6 d，將預先配制好的20 g/L卵蛋白生理鹽水溶液向膝關節內分別注入0.4 mL。在24 h之內膝關節出現紅腫觸痛，表明模型復制成功。在模型復制成功后第2天，用700 mL/L酒精消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋(3份冰+1份結晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20～-25 ℃之間)冷凍1.5 h，在45 ℃溫水中復溫5 min (室溫12℃)。冷凍后14 d，家兔表現為精神萎糜不振；兩后肢匍伏跛行；膝關節腫脹、周徑明顯大于對照組，局部青紫、皮溫不高，表示RA寒證模型建立成功。

1.4針刺方法

造模成功后，各組家兔進行相應處理。足三里穴選取參照《實驗針灸學》[11]家兔常用針灸穴位定位標準，并以比較解剖學為依據定位。正常對照組：不予任何處理，僅每日與針刺組同時給予捆綁和抓取刺激1次。模型對照組：不予任何處理，僅每日與針刺組同時給予捆綁和抓取刺激1次。平補平瀉組：用兔臺固定家兔，以質量分數20 g/L碘酒、體積分數750 mL/L酒精消毒后，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內8 mm，施以平補平瀉法1 min，留針30 min/次, 1 d 1次，共7 d。平補平瀉法操作方法參照《刺法灸法學》[12]：針刺得氣后，施以前后均勻捻轉，指力均勻，角度180°～360°，頻率60～90轉/min，反復操作1 min。捻轉補法組：固定、消毒方法同前，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內8 mm，施以捻轉補法1 min，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。捻轉補法操作方法參照《刺法灸法學》[12]：針刺得氣后，在針下得氣處小幅度前后捻轉針體(角度180°～360°，頻率60～90轉/min)，拇指向前左轉時用力重，指力沉重向下；拇指向后右轉還原時用力輕，反復操作1 min。熱補針法組：固定、消毒方法同前，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內8 mm，施以熱補法1 min，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。熱補針法操作參照《鄭氏針灸全集》[1]：操作者左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續重插輕提5次；拇指再向前連續捻按5次，反復操作1 min，最后使針下沉緊，留針30 min。

1.5檢測指標

采用組織化學染色法觀察組織LDH和ATPase。

1.5.1組織切片制備

將家兔處死，迅速采取關節滑膜組織。恒凍箱切片機切片，厚度6 μm，貼于蓋玻片上風干。ATPase采用鈣鈷法染色，LDH染色采用四唑鹽法，嚴格按照染色試劑盒說明進行切片染色、制備。

1.5.2組織切片定量分析

組織切片經Image pro圖像分析系統對關節滑膜細胞的LDH、ATPase陽性沉淀的圖像分析。計算機軟件分析[Pixel2]表示像素平方，主要用于計算酶染色陽性圖像面積，Areasum[Pixel2]表示陽性總面積；面積百分比是關鍵性指標，表示陽性面積占整個圖片百分數，反映酶相對活性強度；積分光度則是通過酶染色的深淺程度來體現酶活性的大小。

1.6統計學方法

2結果

2.1各組家兔關節滑膜LDH活性變化對比

模型對照組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組的家兔滑膜LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均高于正常對照組，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組滑膜LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均降低，但仍高于正常對照組，差別有統計學意義( (P<0.05)。熱補針法組LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均低于平補平瀉組和捻轉補法組，差別有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與平補平瀉組對比，△P<0.05；與捻轉補法組比較，＊P<0.05。

2.2各組家兔關節滑膜ATPase活性變化對比

與正常對照組對比，模型對照組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比升高，差別均有統計學意義(P<0.05)。平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比均較模型對照組高，差別有統計學意義(P<0.05)。熱補針法組ATPase活性高于平補平瀉組和捻轉補法組，差別有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與平補平瀉組對比，△P<0.05；與捻轉補法組對比，＊P<0.05。

3討論

《針灸大成·三衢楊氏補瀉》曰：“燒山火，能除寒，三進一退熱涌涌……”又曰：“進火針，初進一分，……退三退，進三進，……自然熱矣。”意即燒山火和進火補法均能使機體局部產生熱感，因此稱其為“取熱”手法。熱補針法是鄭毓琳教授、鄭魁山教授簡化燒山火和進火補法而來的，具有“取熱”效應。既然熱補針法能夠使機體局部產生熱感，就說明機體的能量代謝發生了變化；因此，本實驗選擇與能量代謝相關的酶LDH和ATPase作為指標，觀察其對RA寒證模型家兔能量代謝的影響。

卵蛋白誘導的RA模型能很好地模擬人RA病理過程，而且病理過程至少持續8周，在家兔等較大型動物上能夠復制，是研究RA的理想的模型[13]。但是，卵蛋白誘導的RA模型關節局部始終紅腫熱痛，能量代謝異常活躍，類似于人RA發病早期的“熱痹”。冷凍1次后，關節局部皮溫逐漸降低，血沉加快，紅細胞壓積下降，纖維蛋白原增加，肢體血流緩慢，流量減少，與人RA后期的“寒痹”和“風寒濕阻證”相似[10]。前期的預實驗觀察發現，凍后第14天，皮溫降至正常或者稍低，說明低溫應激能使機體能量代謝下降。中醫所謂“寒”就是低溫環境刺激，這種單純疾病動物模型過程中融入中醫病因因素，既符合現代醫學RA病理特點，又體現了中醫辨證論治的特色。

LDH是糖無氧酵解的關鍵酶，廣泛存在于組織細胞內，主要作用是催化乳酸與丙酮酸之間的反應。葡萄糖通過無氧酵解最后被LDH催化生成乳酸。機體在病理條件下，LDH活性增強，催化乳酸氧化，這是機體自動調節的保護性代償機制。當滑膜組織缺氧時，滑膜細胞生理功能被破壞，發生一系列病理生化變化，滑膜細胞變性釋放出LDH、細胞被破壞越多, LDH活性越強。本實驗中模型對照組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組家兔滑膜LDH活性均顯著高于正常對照組(P<0.05)印證了以上觀點。此外，丙酮酸被LDH催化產生大量乳酸，乳酸在體內的大量堆積又會導致機體疲乏無力。本實驗造模成功后，家兔精神萎靡、活動量減少的癥狀與之相符。針刺治療1周后，平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組滑膜LDH活性均向正常水平恢復(P<0.05)，說明各種針刺方法均可使LDH活性降低，這可能是因為針刺可以增強局部血液循環，從而增強了供氧能力，使機體局部組織缺氧狀態得到改善，細胞有氧呼吸增強，相應的無氧呼吸開始減弱，LDH活性也逐漸降低；且熱補針法降低LDH活性的效果優于平補平瀉法和捻轉補法(P<0.05)。研究發現[14]疲勞大鼠骨骼肌中LDH含量明顯增高(P<0.05)，通過服用抗疲勞中藥能明顯降低血清LDH[15]，這與本實驗結果相似。ATPase是細胞膜上重要的離子載體，具有載體和酶的功能，可用于判斷機體能量代謝的強弱。模型對照組ATPase活性增高，可能是因為低溫應激使機體能量代謝下降，機體應激性增高了ATPase活性。針刺治療后，ATPase活性進一步增高，說明這幾種針刺方法均能使機體能量代謝能力增強，以熱補針法的效應最明顯。相似的研究[16]也表明針刺可以使小鼠胃及骨骼肌ATPase活性明顯增強，與本實驗結果相符。

LDH是無氧代謝酶，ATPase是有氧代謝酶，以上的結果提示：針刺能夠降低無氧代謝而增強有氧代謝。熱補針法可增強機體有氧代謝，使機體產生更多的能量，部分轉化為熱能散出體外，這可能就是熱補針法“取熱”的機制；但是機體能量代謝是一個涉及多個環節的復雜過程，僅從兩個能量代謝相關酶的變化來得出上述結論為時過早，還需要進一步的深入研究。

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(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)01-0058-05

中圖分類號:R593.22

文獻標志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.26

作者簡介

杜小正(1973-)，男(漢族)，甘肅蘭州人，博士，副教授，副主任醫師，研究方向：傳統針刺手法治療免疫系統疾病。

* 基金項目：2011年度甘肅省教育廳第二批科研項目(1106B-08)；2010年度甘肅中醫學院中青年科研基金項目(gszyxy2010-4)

收稿日期：2015-06-18；修回日期：2015-11-11