密度梯度離心方式對人工授精結局的影響

朱立華 肖新燕 許玉剛 孫秀芬

山東省聊城市第二人民醫院生殖內分泌科（臨清　252600）

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密度梯度離心方式對人工授精結局的影響

朱立華 肖新燕 許玉剛 孫秀芬

山東省聊城市第二人民醫院生殖內分泌科（臨清252600）

摘要目的 探討精液經密度梯度離心時經水平轉子和角轉子處理后對精液質量及其對人工授精結局的影響。方法 回顧性分析352個人工授精周期，根據梯度離心時轉子的不同，分成水平轉子組和角轉子組兩組，精液經密度梯度離心法處理，形態學分析嚴格按照WHO（World Health Organization）人類精液檢驗與處理實驗手冊第五版標準，比較處理后精液質量及兩組對妊娠結局的影響。結果 （1）精液質量比較：水平轉子組前向運動精子為（89.2±8.5）%、精子濃度為（47.8±14.3）×106/mL、前向運動精子總數為（13.6±6.3）×106；角轉子組前向運動精子為（90.1±8.8）%、精子濃度為（43.4±15.1）×106/mL、前向運動精子總數為（12.9±6.1）×106，無統計學差異 （P＞0. 05）。水平轉子組和角轉子組正常精子比率分別為（18.5±8.2）%和 （14.2±5.7） %，兩者存在顯著性差異（P＜0.05）；（2）妊娠結局比較：水平轉子組的臨床妊娠率為16.5%（30/182）、流產率為 3.3%（1/30）、活產率為 96.7%（29/30）；角轉子組生化妊娠率為臨床妊娠率為12.4%（21/170）、流產率為 9.5%（2/21）、活產率為 90.5%（19/21），無統計學差異（P＞0. 05），生化妊娠率：兩組分別為 0%（0/30），19.2%（5/26），有統計學意義（P＜0.05）。結論 密度梯度離心應用水平轉子可以降低對處理后精液的精子形態的影響，減少生化妊娠率。

關鍵詞授精， 人工； 離心法， 梯密度； 妊娠結局

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.004

夫精宮腔內人工授精（intrauterine insemination，IUI）是一種簡單便捷的輔助生殖技術，對男性不育因素，女性宮頸因素、免疫因素及不明原因的不孕癥治療有較好療效，但是由于受到夫婦雙方各種因素的影響其妊娠率一直偏低，文獻報道成功率僅為5%～15%［1， 2］；精液優選方法在對精子優化過程中，同時影響精子的畸形率，DNA的完整性［3］等，進而影響人工授精結局。本文旨在分析梯度離心時運用角轉子和水平轉子處理精液對人工授精結局的影響。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2011年7月至2014年7月聊城市第二人民醫院生殖醫學科的352個IUI 周期的臨床資料。所有入選病例至少有一側輸卵管通暢， 各周期不孕婦女HCG注射日子宮內膜均為A型（“三線征”）。梯度離心時采用角轉子共 182 個周期；梯度離心時采用水平轉子共170 個周期。

二、方法

（一）精液分析及處理

男方禁欲3～7d，手淫法采集于廣口無菌無毒容器中，置室溫充分液化30min，記錄精液量、液化時間，使用偉力精子檢測系統檢測精子濃度、活動率、a+b級精子比例。采用密度梯度離心法分離精子，將液化后的精液充分混勻加于平衡好的90%、45%的梯度液上層，放入離心機300×g，離心20 min后棄上清，加入1 mL精液清洗液（SAGE-1005）后混勻，300×g，離心20 min，棄上清，沉渣加入0.4～0.5 mL HTF液，置5% CO2培養箱備用于人工授精。

（二）精子形態學分析

精子原液及人工授精備用液于清潔的載玻片上，分別均勻涂片兩片后待其自然干燥，改良巴氏染色，干燥后立即顯微鏡觀察，精子形態分析按照WHO人類精液檢驗與處理實驗手冊第五版標準；患者的兩張涂片各觀察評估至少200個精子，計算兩次評估正常精子比例均值和誤差，確定誤差在可接受的范圍之內（95%可信區間），計算兩次結果平均值。使用偉力精子檢測系統檢測精子濃度、前向運動精子率并根據精液體積計算前向運動精子總數。

（三）治療方案及卵泡監測

1. 自然周期（natural cycle， NC）：周期第10天起B超監測卵泡發育，至優勢卵泡直徑達14 mm 時開始監測尿黃體生成素（luteinizing hormone， LH）峰，出現LH 峰后24h～40 h 左右行IUI。

2. 人絕經期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin， HMG）促排卵周期：從月經第5 天開始用藥，75 u/d，連用5 d 后根據卵泡發育情況增減劑量，卵泡直徑達18 mm 時肌肉注射5000u～10000u，注射HCG 24h～36 h 后行IUI。

3. FSH+HMG：從月經第5天開始用藥， 麗申寶75 u/d，連用5 d 后，卵泡直徑達12mm～13 mm時加用HMG75 u/d，并調節用量至成熟，注射HCG 24h～36 h后行IUI。

4. LE +HMG：月經周期第五天服用來曲唑片（2.5mg/片，北京諾華公司）5mg/ qd×5d，B超監測卵泡大小，接著加用HMG（75u/支）1支/d，根據卵泡大小調整用量直至成熟，注射HCG 24h～36h 后行IUI。

（四）手術方法

受者取膀胱截石位，暴露宮頸后，用1 mL的注射器與特制的無損傷導管連接，吸取經處理后的精子懸液0.3～0.5 mL，將導管輕輕插入宮頸內口，于2～3 min內將精子懸液注入后， 緩慢取出導管， 臀高位仰臥30 min。

（五）黃體支持

對受術者均行黃體支持，使增生期子宮內膜向分泌期轉化，于確定排卵日每日肌注黃體酮40 mg，共 15 d。

（六）臨床妊娠及生化妊娠的判定

通過對尿妊娠免疫試驗或血β- HCG 檢測確定妊娠者進行隨訪。3周后復查B 超， 檢測到孕囊、卵黃囊及心臟搏動者確定為臨床妊娠。3周后復查B 超，監測不到孕囊、卵黃囊及心臟搏動者確定為生化妊娠。

三、統計學處理

采用SPSS 11.0統計軟件進行數據的統計分析，均數的比較采用方差分析，率的差異性分析采用x2檢驗，P＜0. 05為差異有統計學意義。

結　 果

一、水平轉子組與角轉子組患者配偶一般資料比較

梯度離心水平轉子組與角轉子組患者資料對比無顯著性差異 （P＞0.05），見表1。

二、水平轉子組與角轉子組患者促排卵方式和不孕原因比較

梯度離心水平轉子組與角轉子組患者促排卵方式和不孕原因對比無顯著性差異 （P＞0.05），見表2。

三、水平轉子組與角轉子組梯度離心前后精液參數比較

處理后水平轉子組和角轉子組正常精子比率分別為（18.5±8.2）%和（14.2±5.7 ）%，兩者存在顯著性差異（P＜0.05），見表3。

四、水平轉子組與角轉子組妊娠結局比較

IUI后，對患者妊娠結局進行隨訪，水平轉子組和角轉子組生化妊娠率分別為0%（0/30）和 19.2% （5/26），兩者存在顯著性差異（P＜0.05），見表4。

表1　水平轉子組與角轉子組患者配偶一般資料比較

表2　水平轉子組與角轉子組患者促排卵方式和不孕原因比較

表3　水平轉子組與角轉子組梯度離心前后精液質量比較

表4　水平轉子組與角轉子組妊娠結局比較

討　 論

近年來，誘發排卵藥物的改進、精子優化技術的提高、處理液的更新等，使人工授精的臨床應用有了很大的進步。IUI技術是將精液經實驗室處理后，在排卵期注入患者宮腔內以獲得較高的臨床妊娠率。作為人類輔助生殖的關鍵技術之一，精子優選技術直接關系到整個輔助生殖治療的成敗。人工授精影響因素的研究集中在男性精液質量參數，如前向運動精子比率、前向運動精子總數［4］、精子濃度［5］及正常形態精子比率［6-9］；女性因素則認為女性患者年齡［10］、不孕年限、卵泡數目、子宮內膜厚度 、HCG日激素水平、BMI［11-14］等因素和人工授精臨床妊娠率密切相關。

目前，精液優化處理方法主要有上游法、密度梯度心法［15］和直接離心法 ，精液優化的目的是回收大量的前向運動精子或者具有正常形態精子。密度梯度離心法因其具有高回收率的特點，在輔助生殖實驗室的精液優化中大量應用。精子DNA結構的完整性，不但是提高的妊娠率的因素［16］，而且與優生優育也具有十分密切的關系。有人將離心法處理后的精子進行精液質量及DNA完整性檢測，結果表明精子形態、活力、活率、各種運動參數較優選前均有所提高或加強，但離心法處理后的精子，其DNA損傷率較優選前還要高，這表明離心法可對精子DNA結構造成損傷［17］。

本研究中所有周期均采用密度梯度離心法對精液進行優化處理，根據使用轉子的不同隨機分為水平轉子組及角轉子組。并對兩組患者的基礎資料包括：年齡（歲）、不孕年限（年）、卵泡數目（n）、子宮內膜厚度（mm）、 HCG日激素水平、BMI（kg/m2）以及促排方案和不孕原因等在過去研究中認為和人工授精密切相關的女性患者的資料進行比較，結果無顯著差異（P＞0.05）；對可以影響妊娠率的促排方案和不孕原因進行比較，兩組之間無統計學差異（P＞0.05）；對處理前后精液中公認的影響人工授精的參數進行比較發現：處理前兩組患者配偶精液質量：前向運動精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向運動精子總數（×106）、正常形態精子比率（%），無顯著差異（P＞0.05）處理后：前向運動精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向運動精子總數（×106）無顯著差異（P＞0.05），但是兩組正常形態精子比率差異顯著，有統計學意義（P＜0.05），這說明水平轉子的離心過程對精子形態的影響要比角轉子小，可以回收更多的正常形態的精子；對公認的可以影響妊娠率的促排方案和不孕原因進行比較，兩組之間無統計學差異（P＞0. 05）。

人工授精后對妊娠結局隨訪的結果可以看出，兩組在流產率、臨床妊娠率、活產率的比較無差異，然而生化妊娠率角轉子組卻顯著高于水平轉子組，通過本研究推測可能是在離心過程中角轉子較大程度地影響了精子的形態和精子DNA的完整性，致使較水平轉子富集正常形態和具有完整DNA的精子比率低，進而造成生化妊娠率的提高，這有待于進一步的實驗證實。由此我們可以得出結論：密度梯度離心法可以富集大量的前向運動和正常形態的精子，從而達到精子優化的目的；在離心過程中應用水平轉子可以提高處理后精子的正常形態比例，降低生化妊娠率的發生。

參 考 文 獻

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（2015-09-07收稿）

中圖分類號R 321-33

The infl uence of density gradient centrifugation with different mode on the outcome of intrarauterine insemination

Zhu Lihua， Xiao Xinyan， Xu Yugang， Sun Xiufen Productive Medical Department of the 2nd Hospital of Liaocheng ， Linqing 252600， Shandong， China

AbstractObjectiveTo assess the infl uence of density gradient centrifugation with swing-out rotors and fi xed-angle rotors on sperm quality， and the outcomes of intrarauterine insemination（IUI）. Metthhooddss352 IUI cycles were retrospectively analyzed in the study. Semen samples were processed with density gradient centrifugation， and were divided into swing-out rotors group and fi xed-angle rotors group based on different rotors. Sperm quality and morphology were analyzed strictly according to the fi fth edition of the World Health Organization laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sperm quality and outcomes of IUI were comparatively analyzed between the two groups. Ressuullttss（1）Sperm quality∶ There were no signifi cant differences between two groups in the percent of progressive motility sperm， sperm density， the total number of progresive sperm （89.2±8.5）%， （47.8±14.3）×106/mL， （12.9±6.1）×106in swing-out rotors group and （90.1±8.8）%， （43.4±15.1）×106/mL， （12.9±6.1）×106in fi xed-angle rotors group， P＞0.05）， but there was a signifi cant difference in the percent of normal morphology sperm between the two groups（18.5±8.2）% and （14.2±5.7） %， P＜0.05. （2） Outcomes of IUI. There were no signifi cant differences between the two groups in clinical pregnancy rate， abort ratio and live birth rate （16.5%（30/182）， 3.3%（1/30）， 96.7%（29/30） in swing-out rotors group and 12.4%（21/170）， 9.5%（2/21），90.5%（19/21） in fixed-angle rotors group； P＞0.05） . But there was a significant difference in biochemical pregnancy rate 0%（ 0/30） in swing-out rotors group， 19.2%（5/26） in fi xed-angle rotors group； P＜0.05. ConcluussiioonnDensity gradientcentrifugation with swing-out rotors could reduce the infl uence to sperm normal morphology and decrease the biochemical pregnancy rate.

Key wordsinsemination， artifi cial； centrifugation， density gradient；pregnancy outcome