水牛奶中優良乳酸菌的篩選及復合菌株發酵研究

文/馬雨璇吳可非桑 躍葛紹陽張清海劉治麟趙 亮*（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京市高等學校畜產品工程研究中心；2北京農學院食品科學與營養工程學院，食品質量與安全北京實驗室；科迪食品集團股份有限公司；北京和益源生物技術有限公司）

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水牛奶中優良乳酸菌的篩選及復合菌株發酵研究

文/馬雨璇1，2吳可非1，2桑 躍1葛紹陽1張清海3劉治麟4趙 亮1*
（1中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京市高等學校畜產品工程研究中心；2北京農學院食品科學與營養工程學院，食品質量與安全北京實驗室；3科迪食品集團股份有限公司；4北京和益源生物技術有限公司）

摘 要：采用傳統分離方法從水牛奶中分離得到50 株乳酸菌，其中22 株為乳球菌，28 株為乳桿菌。對所有菌株進行產酸性能評價，篩選了4 株性能較好的菌株：乳桿菌KDL22、KDL29，乳球菌KDS25、KDS27。將乳球菌和乳桿菌以1∶1比例進行組合，并對復合菌株的發酵性能進行了研究。結果表明，復合菌株在發酵過程中的產酸速度高于單菌，能在4 h內凝乳，且后酸化較弱，符合工業化發酵劑的要求。通過對4 種復合菌株發酵劑的后酸化能力、產雙乙酰能力、蛋白質水解能力以及發酵乳的感官效果進行比較，最后得出KDL22+KDS25復合菌株發酵牛乳的效果最佳，可作為發酵劑用于酸乳的生產。

關鍵詞：水牛奶；乳酸菌；復合菌株

乳酸菌被廣泛應用于食品加工［1，2］。乳酸菌的分離與篩選是其應用的前提。我國是最早利用乳酸菌發酵食品的國家之一，有著豐富的傳統發酵食品資源［3，4］。

乳酸菌的篩選因素主要包括乳酸菌的酸化能力、后酸化能力、產香味物質能力［5，6］。產酸能力是乳酸菌的重要性質，酸度是影響酸乳加工周期、生產效率及風味的一個重要質量指標，一般通過繪制酸乳在制作過程中酸度隨時間變化的曲線來確定產酸能力的強弱［7］。酸乳的后酸化使酸乳產品在消費過程中酸度升高，導致消費者不可接受的過酸味及感官質量下降，嚴重影響酸乳產品的性質［8］。乳酸菌在乳中生長繁殖，除產生大量乳酸使乳凝固外，還會產生許多風味物質，主要有乙醛、丁二酮、雙乙酰等，這些風味物質的含量和種類決定著產品的適口性［9］。乙醛是酸乳的主要風味物質，其含量決定了成品的風味，可以賦予酸乳理想的香味［9，10］，乙醛的濃度應該在10～40 μg/mL。另外，雙乙酰會形成特征性的類似“奶油”的堅果仁香味［11］，也會大大改善酸乳的風味。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

水牛奶，脫脂乳。

1.1.2 試劑及培養基

氫氧化鈉、三氯乙酸、四硼酸鈉、絲氨酸、鄰苯二甲醛、99%二硫蘇糖醇（DTT）等，均為分析純；MRS培養基、M17培養基，均由實驗室按參考文獻［12］進行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集

水牛奶樣品置于無菌試管中，低溫保存運輸，24 h內處理。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

采用MRS培養基分離乳桿菌，M17培養基分離乳球菌。通過10 倍梯度稀釋得到單克隆菌落，初步根據菌落形態，大小，顏色，培養基中生長位置（表面、內部、底部）挑取不同表觀特征的菌落，并對得到的菌落進行培養。

1.2.3 菌株穩定性試驗

將乳酸菌接種到液體培養基（乳桿菌使用MRS培養基，乳球菌使用M17培養基）中，37 ℃培養15 h后，以3%比例接種于滅菌脫脂乳中，43 ℃發酵，凝乳后記錄凝乳時間；并將凝乳以3%比例繼續接種于新鮮滅菌脫脂乳中，連續傳代記錄凝乳時間。

1.2.4 酸度和pH值的測定

采用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液對發酵乳的酸度進行滴定，具體方法為：稱取10 g左右樣品，置于150 mL錐形瓶中，用40 mL新煮沸冷卻到40 ℃的蒸餾水稀釋均勻，然后滴加3 滴10 g/L酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅，并在30 s內紅色不消失，記錄所用NaOH溶液的體積，計算滴定酸度（°T）。滴定酸度（°T）= V（0.1 moL/L的NaOH溶液體積，mL）/M（發酵乳的質量，g）×100。同時用pH計測定發酵乳的pH值。

1.2.5 雙乙酰含量測定

取一定量的待測乳樣，加入等體積的16%三氯乙酸溶液，混勻，4 °C下4 500 r/min離心10 min，取上清液過濾。向試管中移取濾液5 mL，加入0.5 mL 1%鄰苯二胺溶液，于暗處反應30 min，然后向試管中加入4 mol/L的鹽酸溶液1 mL，終止反應，測定335 nm處的吸光度值［13，14］，根據雙乙酰標準曲線和樣品的吸光度值，計算樣品的雙乙酰含量。

1.2.6 游離氨基酸含量測定

采用鄰苯二甲醛法（OPA）測定游離氨基酸的含量。取0.45 mL發酵乳樣于離心管中，加入0.75 mol/ L三氯乙酸溶液0.9 mL，室溫靜置反應10 min，4 °C下4 500 r/min離心15 min，取上清液0.15 mL，加入3 mL OPA試劑，測定340 nm處的吸光值，以絲氨酸為標準計算最終的游離氨基酸含量［15］。

2 試驗結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選結果與分析

以H2O2酶試驗呈陰性、菌落乳白、革蘭氏染色鏡檢觀察G+球菌和桿菌，作為初步判定為乳酸菌的標準，共分離得到50 株乳酸茵，其中22 株為乳球菌，28 株為乳桿菌。

2.2 轉接試驗及發酵性能優良菌株的篩選

通過凝乳及穩定性試驗，篩選出4 株乳酸菌（表1），這4 株乳酸菌發酵后凝乳性能好，穩定性良好，發酵乳組織狀態、風味均較好。

表1　篩選出單菌株的凝乳情況

2.3 復合菌株發酵特性分析

將乳球菌與乳桿菌按照1∶1比例進行組合，形成4 株復合菌株，分別為KDL22+KDS25、KDL22+KDS27、KDL29+KDS25、KDL29+KDS27，測定復合菌株的產酸性能、后酸化性能、產香性能及蛋白質分解性能。

2.3.1 單菌株及復合菌株的產酸性能

將篩選出的發酵性能優良的4株菌株活化3 代，以3%接種量接種于脫脂乳中。同時將復合菌株以3%接種量接種于脫脂乳中，43 ℃發酵，每小時測定滴定酸度及pH值。從圖1和2可以看出，KDL22單菌發酵酸度達到60 °T的時間在4 h以內，而其它3 株KDL29、KDS25及KDS27單菌所用時間均在6 h以上；除KDL29+KDS25外，其余復合菌株KDL29+KDS27、KDL22+KDS25及 KDL22+KDS27發酵酸度達到60 °T的時間均在4 h內，說明復合菌株初步滿足發酵劑快速產酸的要求。

2.3.2 后酸化性能

4 種復合菌株的后酸化能力如圖3所示，經過4 ℃冷藏3 周后，除KDL29+KDS27外，其它復合菌株的發酵乳酸度變化均在30 °T以內，說明后酸化較弱。4 ℃貯藏過程中酸度變化速度為：KDL22+KDS27 ＜KDL22+KDS25＜KDL29+KDS25 ＜KDL29+KDS27。

2.3.3 產香性能

圖4展示了復合菌株發酵劑在發酵乳發酵及冷藏過程中雙乙酰含量的變化趨勢，除KDL29+KDS27外，其它3 株復合菌株發酵乳的雙乙酰含量均在3 天內達到峰值，其中KDL22+KDS27復合菌株發酵乳的雙乙酰含量最高。

2.3.4 蛋白質分解能力

從圖5可以看出，發酵及冷藏過程中游離氨基酸的含量整體上呈上升趨勢，且游離氨基酸各組之間無顯著差異。

圖1　單菌產酸曲線

圖2　4種復合菌株產酸曲線

圖3　4 ℃冷藏過程中4 種復合菌株發酵乳的酸度變化曲線

圖4　4種復合菌株發酵乳的雙乙酰含量變化曲線

3 結論

本研究從水牛奶中分離獲得了50 株乳酸菌，并從單菌株產酸、凝乳性能方面篩選出4 株適合作為酸乳發酵劑的乳酸菌。將乳球菌和乳桿菌以1∶1比例進行組合后，發現復合菌株的產酸能力、凝乳效果比單菌株好，且后酸化弱。試驗還分別測定了4 種復合菌株發酵乳在4 ℃冷藏過程中的產香能力和蛋白質水解能力，測得3 種復合菌株發酵乳的雙乙酰含量在3 天內達到峰值；蛋白質水解產生的游離氨基酸呈上升趨勢，且各組合之間未發現顯著差異。KDL22+KDS25復合菌株發酵牛乳的效果最佳，可作為發酵劑用于酸乳的生產。

圖5　4 種復合菌株發酵乳的游離氨基酸含量變化曲線

參考文獻

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Screening for Potential Lactic Acid Bacteria for Excellent Yoghurt Starter

MA Yu-xuan1，2，WU Ke-fei1，2，SANG Yue1，GE Shao-yang1，ZHANG Qing-hai3，LIU Zhi-lin4，ZHAO Liang1*
（1 College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product；2 College of Food Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety；3 Kedi Group Company Limitid；4 Beijing Heyiyuan Biotechnology Company Limitid）

Abstract：Fifty strains of lactic acid bacteria were separated from buffalo milk，including twenty-two of Lactococcus and twenty-eight of Lactobacillus. KDL22，KDL29，KDS25 and KDS27 were selected based on the acidity and flavor test. The Lactococcus and Lactobacillus were mixed with the ratio of 1∶1 as a composite strain，and the fermentation performance of four composite strains were examined. The results showed that the composite strains had the better performance with higher acid production rate，and the clotting time could be as short as 4 h，as well as the post-acidification was not so strong. The composite strains could meet the standard of industrialization. The composite strain KDL22+KDS25 was the most excellent for yoghurt starter.

Key words：buffalo milk；lactic acid bacteria；composite strain

［基金項目：本研究受“奶牛產業技術體系北京市創新團隊”“益生菌生產關鍵技術科技成果轉化”項目支持。］

作者簡介：

馬雨璇（1994-），女，本科，研究方向為乳品微生物。

通訊作者：?趙亮（1983-），男，中國農業大學食品科學與營養工程學院副教授，主要從事益生菌科學技術研究。

收稿日期：（2016-04-10）