新型液態發酵生產米香型白酒的研究(Ⅲ)
——純種培養釀酒酵母與傳統小曲協同糖化發酵的研究

唐取來，劉彩霞，肖冬光（教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

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新型液態發酵生產米香型白酒的研究(Ⅲ)
——純種培養釀酒酵母與傳統小曲協同糖化發酵的研究

唐取來，劉彩霞，肖冬光
（教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

摘要：在新型液態發酵條件下，對純種培養釀酒酵母與傳統小曲協同糖化發酵進行研究。實驗結果表明，在傳統小曲發酵過程中接種一定量的純種培養的高產酯、適量低產高級醇的釀酒酵母，能明顯提高原料出酒率和乙酸乙酯的含量，并顯著降低高級醇含量；但釀酒酵母對產酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成。采用分醪發酵工藝可減少酵母菌與傳統小曲協同糖化發酵過程中對產酸菌生長代謝的影響，在提高米香型白酒總酯含量的同時實現風味物質之間的平衡。

關鍵詞：純種培養釀酒酵母；傳統小曲；液態發酵；白酒

優先數字出版時間：2016-03-23；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1517.004.html。

傳統小曲作為米香型白酒釀造中微生物和生物酶的有效載體，在米香型白酒釀造過程中起糖化和發酵的作用，其質量的好壞直接影響米香型白酒的產量和質量，自古就有“曲乃酒之骨”之說［1］。但小曲制造過程是開放式的，很容易受自然環境因素的影響，而且小曲中除含釀酒有益微生物外，同時也夾帶著對釀酒有害的微生物，最終會影響酒的質量［2］。因此，釀造過程中采用純種培養的高產酯、適量低產高級醇的釀酒酵母與傳統小曲協同糖化發酵，補充傳統小曲中釀酒酶系和產酯功能微生物的不足，大幅度增加米香型白酒中酯類香味物質含量，同時還能有效控制高級醇的含量，從而改善小曲酒的品質［3］。傳統小曲中的釀酒微生物經過長期的自然富集與傳代，已形成了一個穩定的微生態環境，菌種間的相互促進和相互制約控制著白酒的風味特點［4］。但白酒發酵過程中微生物互生關系比較復雜，目前它們的互生機理還不十分清楚。因此，研究傳統小曲中產酸菌與酵母菌的協同發酵機理，為傳統釀造的技術改造提供重要的理論依據和實際應用價值［5］。

1材料與方法

1.1材料和儀器

小曲，南方傳統小曲；大米，淀粉含量76.5%，湖南常德金健公司；高產酯、適量低產高級醇釀酒酵母（EY8），天津市工業微生物重點實驗室；商品酶制劑，北京諾維信公司。

高效液相色譜儀、Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：美國安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1釀酒酵母種子培養

一級種子：從試管斜面接種1環高產酯、適量低產高級醇的釀酒酵母于裝有5 mL玉米糖化醪培養基的20 mL試管中，30℃靜止培養24 h，至產生渾濁狀態；二級種子：將一級試管種子液全部倒入裝有100 mL玉米糖化醪培養基的250 mL三角瓶培養中，30℃靜止培養至菌濃度為1×108～2×108個/mL。

1.2.2小曲純糧液態發酵工藝

粉碎后的大米經糊化、液化后，加小曲搖瓶培菌糖化1 d，靜止發酵5 d，總發酵周期6 d。高產酯、低產高級醇釀酒酵母按不同工藝要求在培菌前后加入。米香型白酒分醪發酵工藝如下：

1.3分析方法

酒度測定：酒精計法［6］；總酸總酯測定：指示劑法，參照GB/T 10345—2007；風味物質測定：氣相色譜法［7］。

2結果與分析

2.1純種培養釀酒酵母對小曲純糧液態發酵的影響

純種培養釀酒酵母接種量與接種時間對小曲純糧液態發酵的影響見表1。

表1　純種培養釀酒酵母對小曲純糧液態發酵的影響

從發酵醪酒度看，培菌糖化前接種1%～2%的釀酒酵母，發酵醪酒精含樣量有所提高，比空白對照提高5%左右；其他條件與對照樣基本相當。

從醇類風味物質看，接種純種培養釀酒酵母后，正丙醇、異丁醇和異戊醇的含量明顯減少，而苯乙醇的含量有所增加。其中，培菌糖化前接種1%的釀酒酵母時，正丙醇、異丁醇、異戊醇和總高級醇含量減少最多，分別比對照樣減少65.7%、80.8%、38.7%和57.7%；苯乙醇的含量隨酵母接種量增大而增加，在培菌糖化前接種5%的釀酒酵母時，苯乙醇含量最高達76.5 mg/L，分別為對照樣和培菌后接種的2.0倍和1.4倍。

從酯類風味物質看，接種純種培養釀酒酵母后，乙酸乙酯含量顯著增加，其含量隨酵母接種量增加而增加，且培菌糖化前接種比培菌糖化后接種提高更顯著。培菌糖化前接種5%的釀酒酵母時，乙酯乙酯含量最高達1114.2 mg/L，分別為對照樣和培菌后接種的16.6倍和2.6倍。但釀酒酵母對乳酸乙酯的生成有明顯影響，其中培菌糖化前接種釀酒酵母，乳酸乙酯的生成被完全抑制；培菌糖化后接種5%的釀酒酵母時，乳酸乙酯含量下降22.8%。

從總酸看，接種釀酒酵母后影響產酸菌的生長與代謝，發酵醪總酸含量顯著降低，且隨養酵母接種量的增加，總酸含量相應減少。

2.2米香型白酒分醪發酵工藝研究

由上述的結果可知，在小曲純糧液態發酵工藝中接種純種培養釀酒酵母，雖然能大幅度提高米香型白酒中的乙酸乙酯含量，但釀酒酵母對小曲中的產酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成和酒體風味物質之間的平衡。為此，采用分醪發酵工藝，部分發酵醪保留純小曲發酵，而另一部分發酵醪采用高產酯、低產高級醇釀酒酵母與小曲共同發酵。不同發酵工藝的試驗結果見表2。從表2可知，培菌糖化后按1∶1比例合醪發酵工藝A并沒有消除釀酒酵母對產酸菌的抑制作用，總酸和乳酸乙酸含量與培菌前接種1%釀酒酵母的對照2相同。發酵1 d后，再按1∶1的比例合醪發酵工藝B，可明顯提高總酸和乳酸乙酯含量，總酸提高為對照2的33.3%；而酒度比對照1提高10.4%，乙酸乙酯提高18.7倍左右，高級醇下降33.8%。

表2　不同發酵工藝試驗結果

上述結果可以看出，純種培養釀酒酵母與傳統小曲協同發酵和分醪工藝相結合的方式能達到增酯降醇的效果，但發酵生成的乙酸乙酯含量仍遠高于乳酯乙酯，致使乙酸乙酯、乳酸乙酯比有所失調。將通過改變發酵時間、合醪比例和合醪時間來協同釀酒酵母與傳統小曲的糖化發酵，達到白酒風味物質平衡的目的。

2.2.1延長發酵時間對發酵的影響

表3為純小曲培菌（小曲0.8%）與共同培菌（小曲0.8%和酵母1%）結束并發酵1 d后按1∶1的比例合醪發酵，延長發酵時間后的試驗結果。從結果看，隨發酵時間的延長，酒度、乳酸和乙酸含量變化不大；乙酸乙酯在發酵11 d時達最大值，比發酵7 d時提高10.3%，隨后緩慢下降；乳酸乙酯含量隨發酵時間的延長緩慢增加，發酵17 d的乳酸乙酯含量與發酵7 d的相比，提高了19.0%。

表3　延長發酵時間對發酵的影響

從實驗結果可以看出，乙酸乙酯主要在前期生成，發酵后期會有部分降解；而乳酸乙酯主要在后期生成。由于發酵一定時間，乳酸菌和酵母協同發酵達到微生態環境的飽和狀態，當繼續延長發酵時間，發酵液中各代謝產物的含量基本穩定。從結果看，延長發酵時間，可適當調整乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例，但要達到合適的比例；若發酵時間過長，則效率會下降。

2.2.2合醪比例對發酵的影響

在保持總發酵時間6 d不變的情況下，不同合醪比例對發酵的影響見表4。從結果看，隨著不加酵母醪液比例的增大，酒度、乙酸乙酯含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相應的減小，而總酸和乳酸乙酯含量相應的增加。在合醪比例為7∶3時，與對照1相比，酒度、乙酸乙酯和總酯的含量分別提高5.6%、8.4倍和2.8倍，高級醇下降了24.9%；而與對照2相比，乳酸乙酯、乳酸和總酸分別提高13.2倍、3.0倍、2.3倍。

2.2.3合醪時間對發酵的影響

按7∶3的合醪比例，不同合醪時間對發酵的影響見表5。從結果看，隨合醪時間的延長，乙酸乙酯和總酯的含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相應的減小，但乳酸乙酯、高級醇、總酸和乳酸的含量相應增加。當各自發酵48 h后再合醪，乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例相對平衡，此時的乙酸乙酯、乳酸乙酯比為1.69。以此發酵醪蒸餾所產的白酒，米香純正，酒體醇和協調。

3　結論

3.1在傳統小曲發酵過程中接種一定量的純種培養的高產酯低產高級醇釀酒酵母，能明顯提高乙酸乙酯的含量，并顯著降低高級醇含量；但釀酒酵母對產酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成，其中，在培菌糖化前接種釀酒酵母后，乳酸乙酯的生成完全被抑制，其結果使酒體風味物質之間失去平衡。

3.2采用分醪發酵工藝可減少酵母菌與傳統小曲協同糖化發酵過程中對產酸菌生長代謝的影響，分別培菌并發酵一定時間再合醪發酵，其乳酸乙酯含量比純小曲發酵的還有所提高。純小曲培菌液（小曲用量0.8%）與共同培菌液（小曲用量0.8%，酵母培養液1%）按7∶3比例，各自發酵48 h后，再合醪發酵，與純小曲發酵（對照）比較，總酸含量相當，酒度、乙酸乙酯、乳酸乙酯、總酯的含量分別提高7.0%、6.2倍、6.9%、2.3倍，高級醇含量下降16.5%，乙酸乙酯、乳酸乙酯比從0.28提高至1.69，在大

表4　合醪比例對發酵的影響

表5　合醪時間對發酵的影響

注：對照1為純小曲發酵；對照2為小曲與酵母共同發酵，培菌前接種1%的純種培養釀酒酵母；合醪時間指培菌糖化結束后的發酵時間。

幅度提高米香型白酒總酯含量的同時實現了風味物質之間的平衡，提升了米香型白酒的品質。

參考文獻：

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［2］吳赫川，馬瑩瑩，楊建剛，等.川法小曲白酒發展現狀及其瓶頸問題分析［J］.安徽農業科學，2014，42（33）：11850-11853.

［3］唐取來，李晶晶，李玲玲，等.新型液態發酵生產米香型白酒的研究（I）——酶制劑在液態發酵米香型白酒中的應用［J］.釀酒科技，2015（9）：8-11.

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［5］李凱，彭敦磊，孫端方.傳統大曲微生物多樣性技術研究［J］.釀酒科技，2015（9）：33-36.

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［7］張超，胡可萍，端裕樹，等.快速氣相色譜法分析白酒中的香味組分［J］.色譜，2007（4）：586-589.

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0035-03

基金項目：國家自然科學基金資助項目（3147172）；中國白酒3C計劃項目。

收稿日期：2016-01-12

作者簡介：唐取來（1991-），女，湖南岳陽人，碩士研究生，研究方向為現代釀造技術。

通訊作者：肖冬光（1956-），教授，博士生導師，E-mail：xdg@tust.edu.cn。

Production of Mixiang Baijiu by New-Type Liquid Fermentation（III）：Cooperative Sacchariferous Fermentation of Pure-Bred Cultured Yeast and Traditional Xiaoqu

TANG Qulai，LIU Caixia and XIAO Dongguang
（Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The cooperative sacchariferous fermentation of pure-bred cultured yeast and traditional Xiaoqu was studied in the conditions of newtype liquid fermentation. The experimental results demonstrated that，the inoculation of proper amount of pure-bred cultured yeast with high yield of esters and low yield of higher alcohols in traditional Xiaoqu fermentation process could significantly enhance liquor yield and ethyl acetate content and decrease the content of higher alcohols. However，the obvious inhibiting effects of yeast on acid bacteria would reduce total acids content and influence the synthesis of ethyl lactate. The use of mash-divided fermentation could reduce the inhibiting effects on the growth and metabolism of acid-producing bacteria in the cooperative sacchariferous fermentation and enhance total esters content，meanwhile，the balance among flavoring compounds could be achieved.

Key words：pure-bred cultured yeast；Xiaoqu；liquid fermentation；Baijiu