濃香型大曲中一株產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株篩選及鑒定

劉青青，任劍波，沈才洪，王松濤，喻學(xué)淳，曹振華，敖宗華（.四川理工學(xué)院，四川自貢64000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

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濃香型大曲中一株產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株篩選及鑒定

劉青青1，任劍波2，4，沈才洪2，4，王松濤3，4，喻學(xué)淳3，曹振華1，敖宗華2，4
（1.四川理工學(xué)院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

摘要：為獲得產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株，對10個(gè)不同來源的濃香型大曲樣品進(jìn)行分離純化，共收集到18株紅曲菌株。通過薄層層析法初篩及高效液相色譜法復(fù)篩，得到1株產(chǎn)Monacolin K菌株MY1，通過對其形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，判斷MY1為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

關(guān)鍵詞：微生物；紅曲菌；Monacolin K；篩選；鑒定

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1439.007.html。

紅曲菌（Monascus），在生物學(xué)的分類上屬真菌界，子囊菌門，真子囊菌綱，散子囊菌目，紅曲菌科，紅曲菌屬。紅曲泛指紅曲菌在蒸煮的米飯上發(fā)酵而成的紫紅色產(chǎn)品。在我國自宋朝以來都有廣泛應(yīng)用，宋初《清異錄》中即有“以紅曲煮肉”的記載［1］。《本草綱目》中則記載紅曲能“消食活血，健脾燥胃、治赤白痢下水谷。釀酒，破血行藥勢”［2］。

紅曲中富含生物活性成分，其中以天然色素和降血脂成分Monacolin K應(yīng)用最廣泛［3］。自1976年日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章從紅色紅曲霉發(fā)酵液中首次分離出高活性HM g-CoA還原酶抑制劑Monacolin K，發(fā)現(xiàn)其不但可作為降脂藥物，還具有抑制腫瘤的功效以來，國內(nèi)外科研工作者對紅曲藥用價(jià)值進(jìn)行了大量研究［4］。目前，在歐美Lovastatin（即Monacolin K）已成為治療高血脂癥的首選藥物之一。我國北大維信的血脂康膠囊和成都地奧的脂必妥片都是以功能性紅曲（產(chǎn)品中Monacolin K超過0.4%的紅曲）為原料制成的膠囊和片劑，目前功能性紅曲在市場降血脂產(chǎn)品中有37.2%的占有率［5］。

據(jù)報(bào)道，瀘州老窖國窖大曲曲坯各層中均勻分布著紅曲霉［6］。為篩選得到產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株，進(jìn)一步開發(fā)利用濃香型大曲中有利資源，本次實(shí)驗(yàn)以瀘州老窖濃香型大曲為樣品，通過選擇培養(yǎng)基分離、純化，薄層層析法初篩和高效液相色譜法復(fù)篩，得到1株產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株MY1。通過對其個(gè)體形態(tài)及菌落形態(tài)進(jìn)行描述和鑒定，并提取其總DNA，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行輔助鑒定，判定MY1為紫色紅曲菌。以期為濃香型大曲中有益微生物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種篩選樣品

本次實(shí)驗(yàn)樣品主要選取瀘州老窖制曲車間堆積發(fā)酵過程中出現(xiàn)明顯紅色部位的大曲，共10個(gè)不同樣品。

1.1.2試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：麥芽浸粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、土豆、硫酸鎂、硫酸鋅、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、鏈霉素、過氧膽酸鈉、乳酸、無水乙醇、瓊脂粉、氯仿、環(huán)己烷、異丙醇、甲醇、磷酸等，其中，除甲醇為色譜純外其余均為分析純；蛋白胨、麥芽浸粉為生化試劑；Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品（瑞士Sigma公司）；真菌試劑盒（Omega）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（杰瑞生物工程（上海）有限公司）等。

主要儀器：分析天平、立式高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、烘干箱、離心機(jī)、凝膠成像儀、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀等。

1.1.3培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸粉130 g（加水至1000 mL煮沸）、瓊脂粉18 g，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

PDA培養(yǎng)基：200 g土豆洗凈去皮，切成小塊，加水1000 mL，煮至爛熟，8層紗布過濾，濾液定容至1000 mL，加入葡萄糖20 g，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

察氏培養(yǎng)基：蔗糖20 g，NaNO33 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、K2HPO41 g、瓊脂18 g，加水至1000 mL，乳酸調(diào)pH 6.0，滅菌備用。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g、蛋白胨25 g、MgSO41 g、NaNO32g、K2HPO41g、麥芽浸粉10g，加水至1000mL，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g、秈米米粉20 g、Na-NO34 g、KH2PO43 g、MgSO41 g，加水至1000 mL，乳酸調(diào)pH 6.0，滅菌備用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅曲菌菌株篩選及純化

將中高溫大曲曲心處有粉紅色菌落的部位分別粉碎，各加入稍淹沒曲粉的無菌水，于30℃條件下恒溫培養(yǎng)1 h，即成菌懸液。用無菌水將各菌懸液依次稀釋至10-1～10-7共7個(gè)梯度，分別涂布在改良麥芽汁培養(yǎng)基平板上［7-8］。30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取具有紅曲菌基本形態(tài)特征菌落，轉(zhuǎn)接到改良麥芽汁培養(yǎng)基斜面相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，采用繼代分離純化法進(jìn)行純化培養(yǎng)［9］。

1.2.2產(chǎn)Monacolin K菌株的篩選

發(fā)酵液的制備：將分離純化培養(yǎng)得到的菌株，轉(zhuǎn)接至麥芽汁培養(yǎng)基斜面30℃培養(yǎng)5 d，取菌體制成孢子懸液，按6%接種量接種至液體種子培養(yǎng)基中，以200 r/min、30℃培養(yǎng)48～72 h，至種子液出現(xiàn)微紅色即可。按5%接種量將種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量70 mL/ 250 mL），30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 d。

發(fā)酵液前處理：取發(fā)酵液1 mL，加5 mL乙酸乙酯，30℃、150 r/min條件下振蕩3 h，離心收集上清液，沉淀以5 mL乙酸乙酯抽提2次，合并上清液，蒸干；以少許苯溶解干燥物，待苯揮發(fā)干后，加入0.2 mL甲醇溶解，即完成發(fā)酵液前處理。

薄層層析法初篩：以硅膠為吸附劑，以環(huán)己烷∶氯仿∶異丙醇（V∶V∶V）=6∶3∶1為展開劑，取發(fā)酵液和Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品（Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，0.2 mol/L NaOH溶液定容至100 mL，50℃超聲轉(zhuǎn)化1 h，室溫放置1 h）各10 μL，以10%磷鉬酸為顯色劑，計(jì)算Rf值［10］。

高效液相色譜（HPLC）法復(fù)篩：色譜柱，20 RBA× SB C18，5 μm×150 mm×4.6 mm；柱溫，28℃；紫外檢測器238 nm檢測波長；流動(dòng)相，乙腈∶水=55∶45，磷酸調(diào)pH2.5；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL［11］。

1.2.3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

個(gè)體形態(tài)鑒定：對菌株進(jìn)行電鏡掃描，對比模式菌株電鏡掃描圖像對篩選菌株進(jìn)行分析。

菌落形態(tài)鑒定：采用點(diǎn)植法分別接種于麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察并記錄各單菌落形態(tài)特征。

1.2.4菌株的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：在無菌條件下，取一定量菌絲加入液氮研磨成粉末后，按真菌試劑盒（Omega）的提取方法提取總DNA。

PCR擴(kuò)增：采用ITS1/ITS4作為真菌引物（ITS1：5'-TCCgTAggTgAACCTgC gg-3'，ITS4：5'-TCCTCCgCTTATTgATATgC-3'），對分離的菌種的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；95℃變性4 s，53℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，電壓為12 V/cm，電泳時(shí)間25 min。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行序列比對，并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1紅曲菌篩選結(jié)果

紅曲菌為腐生菌，耐乙醇，嗜酸，極喜乳酸，能在pH值為3.5～6.0范圍生長，最低能耐pH2.5［12］。相對于其他微生物，紅曲菌生長較慢。在平板分離純化過程中易被其他絲狀真菌覆蓋而難以分離純化，因此，本試驗(yàn)中采用改良麥芽汁培養(yǎng)基，即在普通麥芽汁培養(yǎng)基中加入10%無水乙醇，乳酸調(diào)pH5.0，抑制其他微生物的生長，加入0.3%的去氧膽酸鈉抑制真菌菌絲蔓延，1 mg左右氯菌素使之特異性拮抗放線菌和細(xì)菌［13-14］。對不同樣品紅曲菌的分離純化，共得到18株紅曲菌，編號依次為MY1—MY18。

2.2產(chǎn)Monacolin K菌株篩選結(jié)果

用薄層層析法對得到的24株紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行Monacolin K檢測，結(jié)果顯示MY1、MY13、MY16共3株菌在薄層層析后有清晰或較清晰斑點(diǎn)，為Monacolin K陽性菌株（見表1）。其余菌株發(fā)酵產(chǎn)物在同一薄層板上無與標(biāo)樣相同或相近Rf值的展開斑點(diǎn)。初步判斷除該3株菌外其余菌株不具備產(chǎn)Monacolin K能力。

表1　　Monacolin K陽性菌株薄層層析法檢測結(jié)果

應(yīng)用HPLC法對3株Monacolin K陽性菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測，其中僅MY1在14.272 min有吸收峰，與Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間14.260 min相近，其余2株未發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品相近的出峰時(shí)間（詳見圖1、圖2）。綜合薄層層析法和HPLC法的篩選結(jié)果判斷，MY1為1株產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株，Monacolin K含量為0.513mg/mL。

圖1　　 Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

2.3 MY1菌株的微生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1電鏡掃描結(jié)果

對MY1進(jìn)行活化培養(yǎng)后，通過電鏡掃描，得到其個(gè)體形態(tài)，詳見圖3。

2.3.2不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征

30℃恒溫培養(yǎng)7 d，MY1在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)各異，參見表2和圖4、圖5、圖6。

圖2　　 MY1高效液相色譜圖

圖3　 MY1電鏡掃描圖

圖4　 MY1在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

綜合MY1的電鏡掃描個(gè)體形態(tài)與不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征，并與李鐘慶、郭芳編著的《紅曲菌的形態(tài)及分類學(xué)》進(jìn)行對比，判斷MY1為紅曲菌屬菌株，將結(jié)合分子生物學(xué)方法為輔助鑒定手段，得出最終結(jié)論［12］。

2.4 MY1菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對MY1進(jìn)行分子生物學(xué)測序，用ITS1/ITS4擴(kuò)增其ITS區(qū)全長，PCR產(chǎn)物長度500～700 bp，再對500～700 bp左右PCR產(chǎn)物采用試劑盒對其進(jìn)行割膠純化。結(jié)果顯示ITS基因序列長度為558 bp（圖7）。將所得ITS序列分別與genBank中已有序列進(jìn)行比對，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。

表2　　MY1在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征

圖5　 MY1在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖6　 MY1在察氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖7　 MY1菌株基因序列圖

根據(jù)分子生物學(xué)輔助鑒定結(jié)果可知，MY1與Monascus purpureus strain同源性最高，相似性為100%。結(jié)合MY1的電鏡掃描圖及在不同培養(yǎng)基上單菌落形態(tài)特征，最終鑒定MY1為紫色紅曲菌。

3結(jié)論與討論

以10個(gè)不同來源的大曲樣品為原料，采用改良麥芽汁培養(yǎng)基分離純化后，在收集到的18株紅曲菌株中，通過薄層層析法初篩及HPLC復(fù)篩，共得到1株產(chǎn)Monacolin K菌株MY1，通過對其形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，得出MY1的分類學(xué)地位為：真菌界（Eumycophyta），子囊菌門（Ascomycota），真子囊菌綱（Euascomyhcetes），散子囊菌目（Eurtotiales），紅曲菌科（Monascaceae），紅曲菌屬（Monascus），紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

一方面，因紅曲菌代謝產(chǎn)物十分豐富，后續(xù)將對MY1的γ-氨基丁酸、麥角甾醇、桔霉素等其他代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測，以期為進(jìn)一步研究紅曲的相關(guān)功效提供依據(jù)。另一方面，MY1產(chǎn)Monacolin K能力與國內(nèi)外文獻(xiàn)介紹的相關(guān)紅曲菌產(chǎn)Monacolin K能力還有一定差距，如Marlia Singgih等［15］對紅曲菌MFR95固態(tài)發(fā)酵得到Monacolin K含量為1790 μg/g；劉月等［16］得到的紅曲菌F12-11固態(tài)發(fā)酵Monacolin K含量達(dá)8.73 mg/g；Jun Zhang等［17］用紅曲菌9901液態(tài)發(fā)酵得到Monacolin K含量為2026.0 mg/L。后續(xù)將對MY1紅曲菌發(fā)酵理化條件進(jìn)行優(yōu)化，并充分利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)提高M(jìn)Y1產(chǎn)Monacolin K的能力。

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圖8　 MY1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

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中圖分類號：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0038-04

基金項(xiàng)目：四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目《窖泥微生物混合菌群結(jié)構(gòu)分析及釀造微生物的分離鑒定（省院科技合作）》，2015JZ0001。

收稿日期：2016-01-19

作者簡介：劉青青（1990-），女，重慶人，在讀碩士生，主要從事微生物及釀酒生物技術(shù)的研究。

通訊作者：沈才洪（1966-），男，教授級高工，四川省學(xué)術(shù)帶頭人，瀘州老窖有限公司副總經(jīng)理，總工程師。

DOI：10.13746/j.njkj.2016018 10.13746/j.njkj.2015442

Screening and Identification of a Monacolin K-producing Strain from Nongxiang Daqu

LIU Qingqing1，REN Jianbo2，4，SHEN Caihong2，4，WANG Songtao3，4，YU Xuechun3，CAO Zhenhua1and AO Zonghua2，4
（1.Sichuan University of Science & Engineering，Zigong，Sichuan 643000；2. Luzhou Laojiao Co.Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；3. Luzhou Laojiao Health Liquor Co. Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；4 National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Abstract：To obtain Monacolin K-producing Monascus strains，18 Monascus strains were isolated from 10 Nongxiang Daqu samples of difference sources. Through TLC primary screening and HPLC secondary screening，a Monacolin K-producing strain MY1 was finally obtained. It was identified as Monascus purpureus based on morphological identification and molecular biology features.

Key words：microbe；Monascus；Monacolin K；screening；identification