基于核磁共振技術結合多元統計分析的啤酒化學組分定量與品牌鑒別

欒曉菲，沈桂平，鄭彥婕，馮江華，董繼揚（.廈門大學電子科學系，福建省等離子與磁共振研究重點實驗室，福建廈門36005；.深圳市計量質量檢測研究院食品檢測所，廣東深圳58055）

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基于核磁共振技術結合多元統計分析的啤酒化學組分定量與品牌鑒別

欒曉菲1，沈桂平1，鄭彥婕2，馮江華1，董繼揚1
（1.廈門大學電子科學系，福建省等離子與磁共振研究重點實驗室，福建廈門361005；2.深圳市計量質量檢測研究院食品檢測所，廣東深圳518055）

摘要：利用核磁共振技術檢測福建產青島、雪花、雪津麥之初和惠泉一麥等4種不同品牌啤酒的化學組分，結合多元統計方法分析不同啤酒的主成分差異，獲得麥芽糖、葡萄糖、丙氨酸、乙酸等26種主要差異組分。并結合2種重要風味物質甘氨酸、丙酮酸，定量分析這28種主要成分，獲得不同類型啤酒之間的組成差異及它們對啤酒風味的影響；進而建立啤酒的Fisher判別模型，實現不同品牌啤酒的鑒別。本研究可以檢測不同來源啤酒樣品的差異化學成分及含量，又可為其他酒類的鑒定分類提供參考。

關鍵詞：核磁共振；多元統計分析；Fisher判別；啤酒；鑒別

優先數字出版時間：2016-03-24；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1222.008.html。

啤酒是一種含有大量營養成分的低酒精度飲料，發酵后的啤酒有超過100種成分，啤酒各成分含量差異較大，不同的成分會對啤酒的酒質、風味產生不同的影響，各成分之間復雜的相互作用形成啤酒獨特的口感和品質［1-3］。現有的啤酒主要分析方法中，比色法能定量測定啤酒所有的酚類成分［4］，但無法針對某一種特定酚類化合物進行分析；特定化合物含量的分析通常應用薄層色譜法（TLC）來實現［5］，然而這種方法分辨率較低；具有較高分辨率的液相（LC）和氣相（GC）色譜分析法可對多種成分進行定性和定量檢測［3，6］，而GC、LC方法時間較長，也無法實現對被測樣本的無損檢測。

近年來，利用核磁共振（NMR）［7］、氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）［3］、液相色譜與質譜聯用（LC-MS）［6，8］、近紅外光譜［9］等技術獲取食品化學組分信息，實現對食品的分析、鑒別及安全評估，已成為食品研究領域的熱點之一。NMR技術重現性好、檢測時間短（約5 min）、備樣簡單，可為食品分析提供一種快速、無損的檢測方法，并已在葡萄酒［10］、食醋［11］、果汁［12］和啤酒［13］等液態食品的質量控制、成分分析、產地及釀造時間區分等研究得到應用。由于啤酒化學組分復雜，對啤酒的品質鑒定以及質量評價等需要精準的成分分析與定量方法。然而，啤酒的相關研究中一般取啤酒中的某類或幾類物質進行分析［13-16］，較少對不同啤酒進行全局性的差異組分分析及定量與類型判別。因此，研究一種既可以同時檢測、定量多種成分，又能進行品牌分類鑒別的新方法，對啤酒質量的評估、類型鑒別及產品開發等具有較大的指導意義。

本實驗采用1H-NMR技術對福建生產的青島、雪花、雪津麥之初（簡稱雪津）和惠泉一麥（簡稱惠泉）等4種品牌啤酒進行檢測，獲取啤酒的NMR譜輪廓，結合多元統計方法，研究不同品牌啤酒主要成分之間的差異；并對啤酒中的主要差異成分進行定量分析；進而利用差異成分建立Fisher模型，實現對不同啤酒的差異分析、定量與鑒別。

1材料與方法

1.1樣品收集與制備

本實驗收集市售福建產4種品牌不同批次（保質期內）的聽裝啤酒，共39個，見表1。待測樣品放在4℃的冰箱中貯存。

樣品預處理：取啤酒樣品4 mL置于25℃恒溫水浴中進行15 min超聲脫氣處理。取脫氣處理后的啤酒樣1.5 mL，轉移到2 mL玻璃瓶中，進行抽濾以去除乙醇。主要參數如下：干燥箱壓強0.1 MPa，溫度30℃，抽濾10 h。抽濾后啤酒樣品用重水補齊至0.5 mL，振蕩混勻后離心（4℃，10000 r/min，10 min），取上清液300μL與含0.05%TSP的重水300μL混合均勻，再離心，取上清液550μL至5 mm核磁管中，密封保存在4℃冰箱，直至進行NMR實驗時取出。

1.2核磁共振實驗條件及方法

所有實驗在Varian NMR System 500 MHz譜儀（安捷倫科技有限公司，美國加州）上進行，采集樣品的一維1H- NMR譜。實驗采用5 mm反式檢測探頭，實驗溫度298 K，采用預飽和脈沖序列（NOEPR）采樣并抑制水峰信號，其主要參數為：譜寬10 kHz，采樣點數32 k；90°脈沖寬度9.65μs，掃描次數64，采樣時間2.0 s，延遲時間2.0 s，接收增益20。樣品中的重水為鎖場作用，TSP為內標物。

1.3譜圖預處理

采用MestReNOVA軟件（V7.1.0-9185，Mestrelab Research S.L.）及自編軟件MetaboMiner V1.0對譜圖進行手動調相、基線校正和譜峰對齊。去除水峰（δ4.70～δ4.80）及殘留乙醇峰（δ1.15～δ1.20和δ3.60～δ3.75）。取化學位移δ0.50～δ8.50的區域進行自適應積分［17］，盡量使一個譜峰對應一個積分段，最終得到一個39×350的數據矩陣，分別以TSP的譜峰面積和全譜面積對樣本歸一化。將數據導入到SIMIC- P軟件（V14.0，Umetrics AB，Ume?，Sweden）中進行主成分分析（PCA）。

1.4定量分析方法

以TSP在δ0.0位置上的譜峰面積作為標準，對譜圖中各組分的譜峰進行歸一化處理，計算待測物的濃度，公式為：

其中，CTSP為TSP的濃度（0.05 g/100 mL），Sx表示待測物對應的某處譜峰面積，STSP表示TSP的譜峰面積，nTSP表示TSP的質子數，nx表示該峰所對應的基團的質子數，MWx表示物質的分子量，MWTSP表示TSP的分子量。

1.5 Fisher模型及判別方法

為對啤酒進行分類鑒別，我們建立一個多類別的Fisher判別模型［18］。設有k類的樣本集分別為G1，G2，…，Gk，樣本x=（x1，x2，…，xP）T，其判別函數為：

y（x）=c1x1+c2x2+…+cpxP=cTx。（2）

式中：y為判別值，c=（c1，c2，…，cP）T為判別變量的系數向量。

根據組內差異最小，組間差異最大的Fisher準則，選取系數向量c，使Fisher準則函數μ達到最大：

式中，ni為第i類的樣本數，是加權系數；其中i類的樣本均值向量和投影，并代入式（3），則：

表1　　4種福建產啤酒樣本

注：1—脂質；2—異亮氨酸；3—亮氨酸；4—纈氨酸；5—異丁酸；6—鼠李糖；7—乳酸；8—丙氨酸；9—伽馬氨基丁酸；10—脯氨酸；11—乙酸；12—焦谷氨酸；13—丙酮酸；14—琥珀酸；15—二甲胺；16—三甲胺；17—組氨酸；18—膽堿；19—磷酸膽堿；20—甜菜堿；21—甘氨酸；22—淀粉提取糖；23—葡萄糖；24—甘露糖；25—乳糖；26—麥芽糖；27—尿苷；28—肌苷；29—腺苷；30—脫氧尿苷；31—延胡索酸；32—酪氨酸；33—三甲基組氨酸；34—苯丙氨酸；35—色氨酸；36—尿苷二磷酸葡萄糖；37—一甲基腺苷；38—新喋呤。

根據判別函數，對待判樣品進行分類，只需計算待判樣品在歐式空間上，與每個投影面之間的距離Di，距離最近的就將其判為此類［18］。對待判樣品，Di表示為：

2結果與分析

2.1啤酒的1H-NMR圖譜分析

圖1為啤酒的一維1H-NMR圖譜，根據參考文獻［14］及HMDB（http：//www.hmdb.ca）數據庫，對啤酒的化學成分進行歸屬，得到38種物質。4種啤酒譜圖輪廓相似（故僅取典型譜），較強的譜峰主要集中在碳水化合物區（δ 3.00～δ6.00），且譜峰重疊較為嚴重，其大部分屬于淀粉提取糖類，也包括麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、鼠李糖等，說明啤酒中的糖類占很大比重，這應是釀造啤酒所需原料中含有大量的糖所致［7］。脂肪區（δ0.50～δ3.00）主要的化合物類型為氨基酸和有機酸，4種品牌啤酒的成分種類相同，只是個別成分含量不同，其中乳酸的最為明顯。位于低場的芳香區（δ8.50～δ6.00）的物質含量很低，4種啤酒的差異主要體現在尿苷、肌苷等物質的含量不同。總之，4種品牌啤酒化學組成基本相同，但各化合物的含量略有差別。由于譜峰重疊，為定量分析帶來難度，要全面闡明其化學組成差異，尤其是在微量成分上的差異，需進一步借助于多元統計分析。

2.2啤酒1H-NMR譜的PCA分析

圖2（a）為TSP歸一化后所得PCA得分圖，所有樣本均落在95%的置信區域內，無異常點，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）共可解釋73.93%的變量方差，4種不同啤酒在PC1維上明顯區分。這表明，4種啤酒在整體濃度上存在較大差別。圖2（b）為4種啤酒的全譜面積歸一化PCA得分圖。PC1和PC2可解釋57.08%的數據方差。其中，青島啤酒樣品與惠泉樣品略有重疊，這表明青島和惠泉的組成模式相近。

圖2　　 PCA得分圖

2.3主要成分的定量分析

為準確獲得啤酒中差異及風味組分含量，并對比各啤酒的差異，結合多元統計方法對4種啤酒進行分析，獲取28種對啤酒類別區分有重要貢獻的差異化學組分，其結果見表2。

表2　　4種啤酒中28種主要化學組分含量　（mg/L）

由表2可知，麥芽糖含量在4種啤酒的糖類物質中均為最高，這可能是由于釀造啤酒的主要原料為麥芽所致［7］；而4種啤酒中其他糖類含量均依次為葡萄糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、尿苷二磷酸葡萄糖，這些含量變化規律一致，這可能是與所采用原料類似有關，另外產地可能也是一種因素，它們均為福建閩南地區生產。而4種啤酒中青島的糖類物質的含量最高，比較有相同麥汁濃度的雪花與雪津的差異組分，發現雪花啤酒除尿苷二磷酸葡萄糖和組氨酸外其他糖類及氨基酸都高于雪津。青島與惠泉的配料完全一樣，而青島中糖類、氨基酸、膽堿、磷酸膽堿、甜菜堿等較惠泉高。對比發現青島的原麥汁濃度高于惠泉，由此可以推測，啤酒中糖類、氨基酸等物質含量會隨著原麥汁濃度的增大而增大，而膽堿、磷酸膽堿、甜菜堿等物質含量差異，主要與啤酒酵母有關［19］。

在氨基酸類物質中，脯氨酸含量在4種啤酒中均為最高，甘氨酸次之，而其他幾種氨基酸含量相對較低。雪津除甘氨酸、組氨酸外的氨基酸類物質相對含量為4種啤酒最低，青島、雪花、惠泉則較接近；12種氨基酸中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸屬于甜味氨基酸，而苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、組氨酸為苦味氨基酸；焦谷氨酸呈鮮味，酪氨酸呈澀味［1］。計算得青島、雪花、雪津、惠泉的甜味氨基酸濃度總量分別為1193.85 mg/L、800.26 mg/L、657.01 mg/L、915.36 mg/L，苦味氨基酸濃度依次為225.90 mg/L、136.54 mg/L、85.30 mg/L、174.18 mg/L，這表明4種酒樣中青島啤酒口苦、甜味偏重，惠泉次之，而雪花、雪津偏清淡。伽馬氨基丁酸（GABA）含量以青島最高，雪花與雪津較低，并接近相同。GABA的產生與發酵條件、原料關系密切［20］，這也間接反映了4種啤酒中在發酵工藝、原料上還是有所區別。

啤酒中的有機酸主要影響啤酒的風味及pH值［19］，對比表2中乳酸、異丁酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸等5種風味有機酸含量及其風味閾值發現［1-2］：乳酸在4種啤酒中含量均大于其風味閾值（47 mg/L）；而異丁酸、丙酮酸、乙酸則低于各自風味閾值（異丁酸200 mg/L、丙酮酸250 mg/ L、乙酸40 mg/L），這表明4種啤酒均具乳酸風味。而琥珀酸含量，除雪花外，其他3種啤酒的琥珀酸含量都高于風味閾值（65 mg/L）。此外，4種啤酒中有機酸、膽堿等含量不同，這可能由4種啤酒在釀造工藝、發酵方法上的不同所引起［19］。分析有機酸中乳酸含量，發現其會隨著麥汁濃度的減小而上升，即青島啤酒的乳酸含量最低，惠泉次之，而雪花啤酒中乳酸含量最高，這種現象可能與酵母發酵過程有關，即當麥汁中可發酵性糖的總量或濃度低于某一界限值時，發酵液中乳酸將會大量生成［14］，從而引起其含量的增加。然而，與雪花相同麥汁濃度的雪津，乳酸含量卻低于雪花，這可能與其麥芽糖含量較高有關，抑制了發酵液中乳酸的生成。

其他成分中，4種啤酒中尿苷、腺苷等物質含量相對較低，對啤酒的口感作用甚微，它們屬于嘌呤類物質，在啤酒中主要是由麥芽產生，所以4種啤酒中此類物質濃度的高低緣于原麥汁濃度的不同。嘌呤代謝異常容易引發痛風，所以檢測和控制啤酒中此類物質的含量十分必要［1］。

2.4 Fisher判別分析

取2.2節中PCA的前4組主成分的得分數據導入到SPSS軟件（V19.0，IBM SPSS）中，進行Fisher線性判別分析，分別建立了青島、雪花、雪津、惠泉4種啤酒的鑒別模型，得到3個標準化典型判別式函數：

對這3個判別函數進行有效性檢驗，如表3所示。其中1-2表示前兩個函數聯合，2-3則表示第2和第3個函數聯合，3表示第3個判別函數。Wilk’s Lambda表示類內離差交叉乘積矩陣行列式與總離差交叉乘積矩陣行列式的比值，可用于檢驗判別函數的判別能力是否顯著，其值越小判別能力越強［18］。置信水平sig.表明1-2，2-3和3的顯著性水平均為p＜0.001。由此可以看出前兩個及第2個和第3個判別函數的聯合效果顯著，第3個判別函數也顯著；綜上所述，3個Fisher判別式函數對4種啤酒的判別能力是顯著的。

表3　判別函數有效性檢驗

基于Fisher判別函數，對4種啤酒的初始樣本和交叉驗證判別結果見表4，其中交叉驗證采用“留一法”，即判別一個樣本時，將其代入到除去該樣本的所有其他樣本計算的函數中，從而完成判別。初始樣本包括39個樣品，青島、雪花、雪津、惠泉均被準確判別，總的判別正確率為100%。交叉驗證分析39個樣品，同樣4種啤酒全部正確判別，總的判別正確率為100%。由此說明建立的判別模型簡單、可靠。為了更加直觀地觀察類內聚集情況和類間距離大小，我們根據前兩個Fisher判別函數得分繪制如圖3所示的二維散點圖。橫坐標表示判別函數1的得分，縱坐標表示判別函數2的得分。由圖3可得：每一類啤酒分布比較集中，而類與類之間明顯分開，清晰可辨。

3　結論

基于NMR技術采集青島、雪花、雪津麥之初和惠泉一麥等4種不同品牌啤酒的NMR圖譜，利用多元統計方法分析獲得了不同啤酒在糖類、氨基酸類及有機酸類中的26種差異組分，并結合2種重要風味物質，進一步定量闡明各啤酒間的組分差異，分析這些組分對啤酒品質的影響，進而建立基于Fisher判別的啤酒分類判別模型。研究結果表明：4種啤酒中糖類、氨基酸類含量隨原麥汁濃度升高而增大；而相同原麥汁濃度，由于釀造工藝、條件及原料差異，有機酸含量略有差別；不同品牌啤酒在呈味酸部分差異顯著，從而體現不同啤酒的各自獨特風味。而Fisher判別模型實現了對不同品牌啤酒的準確分類鑒別。總之，本研究基于NMR技術，將多元統計方法、定量分析及Fisher判別模型相結合，建立一種啤酒的檢測、分析與鑒別新方法，可為其他酒類及液態食品的檢測、鑒別提供方法參考。

表4　　4種啤酒的初始樣本與交叉驗證結果

圖3　判別函數二維得分圖

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中圖分類號：TS262.5；TS261.7；O657.61

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0048-06

基金項目：國家自然科學基金項目（31372546，81371639）；福建省自然科學基金項目（2014J01247，2015Y0032）；中央高校基本科研業務費項目（20720150018）。

收稿日期：2016-02-15

作者簡介：欒曉菲（1989-），女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：核磁共振新技術與食品分析。

通訊作者：沈桂平，E-mail：gpshen@xmu.edu.cn。

Compositional Quantitation and Brand Identification of Beer via NMR Approach Combined with Multivariate Statistical Analysis

LUAN Xiaofei1，SHEN Guiping1，ZHENG Yanjie2，FENG Jianghua1and DONG Jiyang1
（1. Fujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance，Department of Electronic Science，Xiamen University，Xiamen，Fujian 361005；2. Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong 518055，China）

Abstract：In this study，the chemical components of four beer samples of different brands including Tsingtao，Snow，Xuejin and Huiquan were

quantitatively analyzed using NMR spectroscopy，and their differential components were identified by multivariate statistical analysis. 26 differential components were obtained，including maltose，glucose，alanine and organic acids. Quantitative analysis of the 26 components plus 2 important flavoring components glycine and pyruvate acid were carried out to confirm the compositional differences between these four kinds of beer and to understand their influence on the special flavor of beer. Furthermore，Fisher classification discriminant model was successfully established for the identification of beer of different brands. This study provided a new method to detect the chemical components and their content in beer of different brands，and a useful reference for the classification of other alcoholic drinks.

Key words：nuclear magnetic resonance；multivariate statistical analysis；Fisher discriminant；beer；identification