春夏兩季濃香型白酒糟醅中四大有機酸的變化及其對酒質的影響

張　方，鄧　波，張宿義，蘇占元，宋　川，敖宗華（.四川理工學院生物工程學院，四川自貢63000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州66000；3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州66000；.國家酒類及加工食品質量監督檢驗中心瀘州實驗室，四川瀘州66000）

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春夏兩季濃香型白酒糟醅中四大有機酸的變化及其對酒質的影響

張方1，鄧波2，3，張宿義2，3，蘇占元4，宋川2，3，敖宗華2，3
（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000；4.國家酒類及加工食品質量監督檢驗中心瀘州實驗室，四川瀘州646000）

摘要：采用氣相色譜法和對羥基聯苯比色法，通過連續跟蹤春夏兩季濃香型白酒糟醅中四大有機酸（己酸、乙酸、乳酸及丁酸）的變化，并對春夏兩季所產白酒酒樣進行理化分析和感官嘗評，從而判斷出發酵過程中四大酸與白酒酒質的關系。結果表明，除了乳酸，其他3種有機酸的含量均為春季大于夏季的。春季的酒質優于夏季，且其中己酸乙酯的含量明顯高于夏季。

關鍵詞：濃香型白酒；糟醅；有機酸；白酒

在濃香型白酒中，酯類、酸類、醇類、醛等微量成分雖只占總量的2%，但是其量比關系卻決定著白酒的品質及口感。其中有機酸是濃香型白酒的重要呈味物質之一，它的絕對含量在微量成分中僅次于酯類，約為總酯含量的1/4［1］。在白酒發酵過程中，酒醅中的酸度變化影響著酒醅中微生物的生長代謝，同時，有機酸作為相應酯類的前體物質，其種類、含量和比例都直接影響著發酵生成酯類的多少。因此，在濃香型白酒的發酵過程中，有機酸對酒醅發酵和白酒品質都有著較大影響［2-3］。前人對白酒中的香味成分作了大量的研究，而對糟醅中有機酸的研究還甚少，尤其是不同季節對于濃香型白酒糟醅中有機酸變化的影響研究還幾乎處于空白狀態［4-5］。本研究通過跟蹤春夏兩季濃香型白酒中四大有機酸的變化，并對白酒酒樣進行理化分析和感官嘗評，探索有機酸對白酒酒質的影響。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

糟醅及酒樣：取自四川省某名酒廠。

儀器設備：DHG-9123A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司），BSA822-CW感量天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司），100 mL瓷蒸發皿，DL-1萬用電爐（北京中興偉業儀器有限公司），酸堿滴定儀器，7890N氣相色譜儀（U.S. Agileat Technologies），紫外可見分光光度計UV1600 PC（上海美普達儀器有限公司），數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

試劑：無水乙醇，己酸，乙酸，丁酸，己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯，丁酸乙酯，無水乳酸鋰，對羥基聯苯，鎢酸鈉，硫酸銅，氫氧化鈣，濃硫酸等均為分析純試劑；乙酸正戊酯，乙酸正丁酯，以上試劑為色譜純。

1.2實驗方法

1.2.1糟醅中有機酸的提取

稱取酒醅樣品5 g，加入60%的乙醇溶液，攪拌均勻后在25℃下超聲波振蕩浸提60 min后，將浸提液以12000 r/min離心10 min，然后用0.45 μm濾膜過濾，制成有機酸提取液。

1.2.2有機酸等微量成分的測定

色譜條件：毛細管柱為LZP-930B白酒分析專用柱（18 m×0.53 mm×1.0 um）；載體為Chromosorb W（AW），80～100目；固定液為20%DNP加7%吐溫80；載氣（高純氮）；流速為0.5～1.0 mL/min，分流比約為37∶1，尾吹氣為20～30 mL/min；氫氣流速為40 mL/min；空氣流速為400 mL/min；檢測器和注樣器的溫度均為220℃；柱溫的起始溫度為60℃，恒溫6～8 min，以5℃/min程序升溫至220℃，繼續恒溫10 min。

1.2.3對羥基聯苯法測定乳酸［8-9］

樣品的處理：將有機酸提取液稀釋后，吸取2 mL稀釋液并加入2 mL鎢酸溶液混勻靜置至溶液出現明顯絮狀物，10000 r/min離心10 min后取上清液，并將上清液置于60℃水浴中保溫30 min，冷卻待用。

標準曲線的制作：用200 μg/mL乳酸標準液同有機酸提取液預處理后，配置成0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的不同梯度的乳酸標準溶液。取上述標液分別加50 mg氫氧化鈣粉末和20%的硫酸銅溶液混勻后沸水浴3 min，冷卻后3000 r/min離心5 min。取上清液0.5 mL加入6 mL濃硫酸混勻后沸水浴5 min迅速冷卻，將0.125 mL對羥基聯苯溶液加入其中混勻靜置15 min，沸水浴5 min再冷卻待測，使用紫外分光光度計測定在波長565 nm處的吸光度值。乳酸含量的測定參照參考文獻［9］的方法測定。

1.2.4糟醅中酸度的測定［2］

酸度：參照參考文獻［2］的方法測定。

2結果與分析

2.1乳酸標準曲線及春夏兩季糟醅發酵過程中乳酸的變化

2.1.1乳酸標準曲線的制作

乳酸標準曲線見圖1。

圖1　乳酸標準曲線

由圖1可知，根據1.2.3中方法做出乳酸的標準曲線方程為：

y=0.0136x-0.1175（R2=0.9928）。

其中：y為吸光度；x為乳酸標液濃度（μg/mL）。

2.1.2春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中乳酸的變化

乳酸是濃香型白酒中四大有機酸之一，是構成白酒風味的主要物質。在濃香型白酒發酵過程中如果乳酸的量比適當，它不但對入窖酸度的調節有一定作用，還能夠抑制細菌的過早、過度增長［10］。通過跟蹤糟醅發酵過程中的乳酸的變化規律，能夠反映出微生物的代謝情況。糟醅發酵過程中乳酸變化見圖2。

圖2　春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中乳酸的變化

結合1.2.3的測定方法和圖1的標準曲線測得春夏兩季發酵糟醅中的乳酸，由圖2可知，春夏兩季的變化趨勢大體一致，在15 d左右上升到第一個峰值，中間有小幅度的波動，30～40 d時到最高點后緩慢下降最后趨于平穩。在發酵前期，窖池中氧氣充足，微生物數量快速增加且酵母菌占主導地位；15 d左右時，乳酸含量有小幅度下降，這可能是由于發酵前期窖池中的微生物消耗了大量的氧氣、氮源、碳源等物質，此時能源處于供給不足狀態，乳酸作為反應物被消耗利用，并且部分乳酸酯化反應生成乳酸乙酯使得同時期窖池中的乳酸乙酯含量明顯的增高；當糟醅發酵到中后期（30～40 d）時氧氣已被大量消耗，此時發酵由細菌（乳酸菌、毛霉菌、根霉菌）等主導，這些細菌發生厭氧反應生成大量的乳酸，故此時乳酸的含量達到最高點，春季為14.732 mg/g，夏季則高達16.638 mg/g；在40 d后主要為產酯期，乳酸和相應的乙醇發生酯化反應生成大量的乳酸乙酯，故此時的乳酸含量處于比較平穩的時期。總體上，春季白酒糟醅中乳酸含量都要低于夏季，主要是因為夏季比春季的溫度和入窖酸度高，入窖溫度高，不利于酵母菌充分發酵而致其過快衰亡［11］，細菌占主導地位時間過長，乳酸含量過高。

2.2春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中乙酸的變化

在濃香型白酒中，乙酸是僅次于己酸的一種重要有機酸。白酒發酵期間，乙酸即伴隨著酒精產生，它是酒精發酵不可避免的產物，同時還是丁酸、己酸、乙酸乙酯的前體物質，故乙酸在白酒發酵中占有很重要的地位［3］。糟醅發酵過程中乙酸的變化見圖3。

圖3　濃香型白酒糟醅發酵過程中乙酸的變化

由圖3可知，乙酸伴隨著酒精的生成同時出現，糟醅中乙酸含量在發酵初期緩慢增長，在15 d左右達到第1個峰值，這主要是因為醋酸菌作為生成乙酸的主要菌種在發酵前期有充足的能源和氧氣供其生長代謝，此時它作為優勢菌種繁殖并產生乙酸，同時部分酵母菌在無氧呼吸的條件下生成酒精的同時還伴隨著乙酸的生成，春季較夏季更快產生酒精且春季的入窖溫度和酸度都比夏季更適合醋酸菌的生長，所以，春季入窖后初期糟醅中乙酸含量要比夏季更早達到第1個峰值。當到達發酵中后期（產酸期）時，春夏兩季的糟醅中乙酸達到第2個峰值，但春季糟醅中乙酸的含量明顯低于夏季，這可能是因為此時雖然醋酸菌大量死亡，但酒醅中已生成大量酒精，部分乙醇氧化生成乙醛后發生歧化作用再生成乙酸，而夏季溫度較高，大量厭氧型微生物生長旺盛代謝產生乙酸，夏季糟醅中乙酸乙酯含量明顯升高且多于春季糟醅［12］，所以在發酵后期，春季糟醅中乙酸含量低于夏季。

2.3春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中己酸的變化

己酸作為己酸乙酯的前體物質，同時也是白酒中一種重要的呈香呈味物質。據報道［13］，己酸含量的適當增加對于己酸乙酯的水解有一定的抑制作用，在發酵過程中己酸的含量決定著白酒中己酸乙酯的含量，故跟蹤白酒發酵過程中己酸的含量對白酒生產有一定的指導作用。糟醅發酵過程中己酸的變化見圖4。

圖4　春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中己酸的變化

由圖4可知，在春夏兩季糟醅發酵過程中，糟醅中己酸含量在10～20 d之間達到第1個小高峰，春季的峰值為0.0442 mg/g，而夏季的峰值僅為0.0179 mg/g。隨后又有一個大幅度的下降，在白酒發酵中后期（產酸期），己酸含量達到第2個峰值，此時窖池中的氧氣被好氧微生物大量消耗并衰亡，己酸菌（也叫科拉瓦氏梭菌）等兼性厭氧型細菌此時處于較為活躍的狀態，它將酒精和乙酸經過一系列的縮合還原以及水解反應合成為丁酸和己酸，此時若糟醅中的乙醇多于乙酸時，它的主要產物為己酸。春季在35 d時糟醅中己酸含量為0.0555 mg/g，明顯大于夏季。這可能是由于夏季糟醅發酵過程中乳酸的含量偏高，對己酸菌等有益的微生物有一定的抑制作用，從而導致夏季糟醅中己酸含量降低［14］。后期由于己酸與酒精通過酰基輔酶A反應生成己酸乙酯，同時己酸菌也可以利用乙酸乙酯為承受體生成己酸乙酯，從而造成糟醅中己酸的消耗減少和己酸乙酯含量的增加。

2.4春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中丁酸的變化

丁酸是濃香型白酒中四大最主要有機酸中含量最低的一種，占總酸的9%。丁酸含量雖低，然而它作為發酵過程中許多香味物質的中間物質和丁酸乙酯的前體物對白酒發酵過程有著重要的影響［1］。白酒糟醅發酵過程中丁酸的變化見圖5。

由圖5可知，春夏兩季糟醅入窖時丁酸含量幾乎一致，前10 d的變化較為平緩，在10～20 d時丁酸含量出現第1個峰值，春季達到了0.0667 mg/g，而夏季低于春季，僅為0.0504 mg/g。當發酵進入中后期時，窖池中的微生物大部分開始進行無氧呼吸，丁酸菌、異型乳酸菌、己酸菌等細菌處于活躍狀態，其中丁酸菌利用糟醅中的糖類、氨基酸、乙酸和酒精等生成丁酸，還能夠利用乳酸代謝生成丁酸，部分己酸菌還能夠利用乙醇和乙酸形成丁酸，所以此時糟醅中的丁酸富集達到最高點［12］。在發酵后期，丁酸菌大量死亡且丁酸又作為底物被其他微生物消耗轉化為丁酸乙酯、己酸等其他產物而大幅度減少。春季由于同一時間點的酸度低于夏季，乳酸菌對丁酸菌的抑制作用較低，故春季糟醅中丁酸含量要高于夏季。

圖5　春夏兩季濃香型白酒發酵糟醅中丁酸含量的變化

2.5春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中酸度的變化

濃香型白酒發酵過程中酸度變化主要是由糟醅中的有機酸含量的改變所引起的，所以跟蹤白酒發酵過程中酸度的變化可以反映有機酸總含量的變化趨勢，并對研究白酒中四大有機酸的變化有著指導作用。糟醅發酵過程中酸度的變化見圖6。

圖6　濃香型白酒糟醅發酵過程中酸度的變化

由圖6可知，春夏兩季發酵糟醅中的酸度隨著時間的變化而呈上升趨勢，在出窖時會有小幅度下降。這是由于在整個發酵過程中，窖池中微生物的生長代謝造成了有機酸總量不斷增長，出窖前采取的滴窖等降酸措施造成后期酸度下降。0～10 d時，酵母菌的生長繁殖占有優勢，以產酒精為主，導致酸度增長較為緩慢；在35 d左右，酸度達到最大，并且夏季的酸度要大于春季。這一方面是因為夏季的入窖糟醅中的酸度比春季的高［2］，另一方面是夏季的溫度更有利于細菌等微生物的繁殖代謝，酵母菌產酒精的時間明顯比春季短的同時更早進入產酸期。

2.6春夏兩季濃香型白酒糟醅中四大酯含量的變化

濃香型白酒中，酯類含量約占香味成分總量的60%，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯在濃香型酯類組分含量中占90%～95%，其中己酸乙酯是濃香型白酒的主體香氣成分，在一定濃度范圍內決定著濃香型白酒品質的優劣，同時，白酒中的其他酯類與己酸乙酯含量的比例關系也影響著白酒的酒體風格。春夏兩季濃香型白酒糟醅發酵過程中四大酯含量的變化見表1。

表1顯示出在整個發酵過程中，酯類的含量一直處于逐漸上升的狀態，在25 d以后增長速度加快，這主要是發酵前期以碳源、氮源、酯類物質消耗代謝為主，到發酵后期，氧氣消耗殆盡以及代謝產物大量積累，此時厭氧和兼性厭氧型細菌處于主導地位，它們產生大量的酸類、醛類、酯類等次級代謝產物，這些有機酸類物質在酯化酶和酰基輔酶A的作用下乙酯化合成其相應的酯類物質，從而造成酒糟中酯類的富集。由表1還可看出，春季發酵糟醅中己酸含量高于夏季，相應的春季酒糟中己酸乙酯含量也明顯較夏季要多，但是乳酸和乳酸乙酯的含量較夏季的少，春季發酵糟醅中乙酸和乙酸乙酯含量的增長較為平緩，而夏季在發酵后期，乙酸和乙酸乙酯的含量增長較快，這不利于發酵過程中酒精的生成；春季糟醅中丁酸和丁酸乙酯的含量也高于春季。

2.7酒樣分析

2.7.1酒樣的理化分析

當整個發酵周期結束后，車間小組工作人員將出窖糟醅進行蒸餾流酒并分段摘酒，取二段綜合樣進行氣相色譜分析得酒樣中的香味成分含量，結果見表2。

由表2可知，春季酒樣中的己酸和己酸乙酯含量明顯高于夏季，而乳酸和乳酸乙酯含量低于夏季，各香味成分之間的量比關系也要優于夏季。這一結果與發酵過程中酸類和對應酯類的變化趨勢一致。

表1　春夏兩季濃香型白酒糟醅中四大酯含量的變化　（mg/g）

表2　春夏兩季二段綜合酒樣中香味成分含量（g/L，折算成60%vol）

2.7.2出酒率及酒樣的感官評價

按照實驗的安排，實驗窖池發酵完成后蒸酒，采用分段摘酒的方式對酒樣進行計重并測量酒精度，將記錄數值折算為20℃、60%vol時的重量來計算出酒率。出酒率=產酒總量/糧食總量×100%。酒樣的嘗評是邀請包括國家級白酒品酒委員在內的專業品酒組對所取酒樣進行品評和打分的過程。鑒定結果見表3。

表3　出酒率及酒樣的感官評價

由表3可看出，夏季的出酒率比春季略高，然而口感比春季稍差，糟香和窖香不如春季突出。這主要是由于夏季的入窖溫度過高且入窖酸度也偏高，這種環境不利于酵母菌的生長繁殖，反而更有利于雜菌的滋生繁衍，產生一些不利于發酵生產和白酒品質的次級代謝產物（如正丁醇、糠醛、丙烯醛等），這些物質會導致基酒澀雜等不正常的口感。

3　結論

本研究，通過對比春夏兩季發酵糟醅中4種有機酸的變化規律，發現除了乳酸外其他3種有機酸的含量均是春季大于夏季。在整個發酵周期內，除30～40 d時有機酸的變化有一個較為明顯的波峰，4種有機酸的變化趨勢大體上與酸度的變化一致。在30～40 d之間，細菌等微生物的繁殖代謝不僅生成了酸類物質，同時還進行著酯化、水解等一系列復雜的生化反應，所以，雖然某一種有機酸的含量增長，但酸類物質的總量并未增長太多，且濃香型白酒發酵糟醅中四大有機酸的含量大小排列為乳酸＞乙酸＞己酸＞丁酸，這一方面是由于瀘型酒主要采用續糟發酵工藝，乳酸等不揮發性物質隨著母糟帶入到酒糟中；另一方面是因為窖池是一個偏酸性的環境，更有利于乳酸菌的生長代謝而生成更多的乳酸。

在蒸餾的基酒酒樣中，乳酸的含量并沒有明顯的大于乙酸。這可能是由于這兩種有機酸的沸點接近，乙酸的沸點更高更易液化析出。通過酒樣的理化分析和感官嘗評打分發現，夏季的整個發酵過程中，酸度和乳酸的含量高于春季，而夏季的酒樣的感官評價較差，其中己酸乙酯含量偏低而乳酸乙酯含量較高，這一現象進一步證明了生產過程中乳酸和乳酸乙酯的適當減少有利于己酸乙酯含量的提高，同時也為“增己、降乳”這一理論提供了科學的論據。

總之，本實驗結合生產實際考察濃香型白酒發酵糟醅中四大有機酸的變化規律及相應酒樣的品質，進一步驗證酸對于白酒生產的影響及其與白酒品質的聯系，故在車間生產期間應結合實際情況，適當改進發酵環境、生產工藝和工人操作等，如窖泥養護、滴窖、緩慢上甑、緩火蒸餾、夏季減少投糠量等措施來達到降低酸度的同時達到“增己降乳”的作用。

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中圖分類號：TS262.3；TS261.7；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0070-05

基金項目：四川省科技支撐項目《基于風味指紋圖譜的微生物強化共培技術研究及應用》（2014SZ0129）。

收稿日期：2016-02-26

作者簡介：張方（1988-），女，碩士研究生，研究方向：釀酒生物技術。

通訊作者：張宿義（1971-），男，博士，碩士生導師，國家級白酒評委，中國釀酒大師，享受國務院特殊津貼專家，發表論文100余篇，獲授權專利78項。優先數字出版時間：2016-04-01；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160401.1342.005.html。

DOI：10.13746/j.njkj.2016056

The Changes of Four Main Organic Acids in Fermented Grains of Nongxiang Baijiu in Spring and in Summer and Their Effects on Liquor Quality

ZHANG Fang1，DENG Bo2，3，ZHANG Suyi2，3，SU Zhanyuan4，SONG Chuan2，3and AO Zonghua2，3
（1. College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong，Sichuan 643000；2. Luzhou Laojiao Co. Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；3. National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Luzhou，Sichuan 646000；4. Luzhou Lab of National Quality Inspection & Supervision Center for Alcoholic Drinks & Processed Food，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Abstract：The relationships between four main organic acids and liquor quality in fermentation process were analyzed through continuous tracing measurement of the changes of four organic acids（caproic acid，acetic acid，lactic acid and butyric acid）in spring and in summer by GC and p-hydroxydiphenyl colorimetry and physiochemical analysis and sensory assessment of the produced liquor samples. The results showed that，the content of the three organic acids except lactic acid was higher in spring than in summer，liquor quality in spring was better than that in summer，and the content of ethyl caproate in spring was significantly higher than that in summer.

Key words：Nongxiang Baijiu；fermented grains；organic acids；Baijiu