重組禽流感病毒滅活疫苗生產工藝的優化

張婷婷

摘要：禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型（也稱禽流感病毒）引起禽發生急性出血性的傳染性疾病，以引發呼吸道發病或隱性感染為特點。目前疫苗免疫接種是預防本病的主要措施。在產業化滅活疫苗生產過程中，傳統滅活工藝（使用2%的甲醛作為滅活劑）存在著局限性，其中甲醛含量雖未超過國家標準，但多余的游離甲醛醛基不斷降解病毒的抗原，致使抗體效價降低、保存期縮短以及動物機體副反應的發生。

關鍵詞：滅活工藝；病毒濃縮；重組禽流感病毒滅活疫苗

1.禽流感概述及現行工藝討論

禽流感（AvianInfluenza，AI）是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型引起禽發生急性出血性的傳染性疾病，以引發呼吸道發病或隱性感染為特點。禽流感病毒依據血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的抗原特性，將禽流感病毒分成15種特異的血凝素亞型病毒和9種特異的神經氨酸酶亞型病毒翻。不同禽流感亞型病毒毒力差異很大，同一亞型內不同的毒株及同一毒株感染不同宿主時其毒力也不盡相同。非致病性毒株和低致病力毒株感染后，往往只引起感染動物一些輕微的臨診癥狀；而高致病力毒株即可引起大于70%以上的感染動物死亡率。禽流感病毒感染后可以表現為輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低；或表現為較嚴重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高。這種癥狀上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型決定的。

2.甲醛在禽流感疫苗滅活中的主要問題

目前，在禽流感疫苗生產中，用甲醛作為滅活劑進行病毒的滅活。甲醛是一種有強烈刺激性的致癌物質。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基（如A，G，u），又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時，易使蛋白質發生交聯或病毒顆粒聚集，不能再作用于殼蛋白內的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會遭到嚴重破壞，并可能有病原體存活。故而為了使病原得到充分的滅活，以免發生散毒事故發生，在疫苗生產過程中，均采用加大甲醛濃度及延長滅活時間等措施。這樣的結果就可能造成，疫苗產品中殘留大量游離甲醛，若隨疫苗注入機體后，會產生刺激性反應。且在疫苗的保存過程中，多余的游離甲醛醛基不斷作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐漸降解，這樣疫苗中的有效成分不斷流逝，不僅縮短了疫苗的保存期，還降低了疫苗免疫動物后抗體水平的產生。

3.材料與方法

3.1實驗材料

3.1.1毒株、雞胚和實驗動物

1）毒株重組禽流感病毒H5亞型二價（Re-6株+Re-8株）

2）非免疫雞

3）SPF雞

3.1.2主要生物制劑及化學制劑硝酸纖維素膜（NC膜）、膜包、白油（進口佐劑）、司苯-80、吐溫-80、硬脂酸鋁、甲醛溶液。

3.1.3主要儀器設備 抗原濃縮設備、自動控制全不銹鋼乳化罐和滅活罐、純水系統Milli-QPLUS、漩渦混合儀。

3.2實驗方法

3.2.1重組禽流感病毒滅活疫苗原液的制備 選擇的重組禽流感病毒H5亞型二價（Re-6株+Re-8株）用滅菌的生理鹽水做10-4稀釋，接種于發育良好孵化的10～11胚齡健康易感的SPF雞胚上，每胚0.1mL，置36℃溫室內孵育。等待觀察，雞胚接種后，照蛋2次/d，將24h內死胚棄去直至72h后，全部取出置于2～8℃冷卻12h。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術除去氣室部卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，完成重組禽流感病毒滅活疫苗原液的制備。

3.2.2傳統滅活工藝 將無菌檢驗合格的重組禽流感病毒滅活疫苗原液混合于一個滅活罐內，吸取數毫升樣品用于毒價檢測。其余病毒原液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%。

3.2.3新的滅活工藝 將無菌檢驗合格的重組禽流感病毒滅活疫苗原液混合于一個滅活罐內，吸取數毫升樣品用于毒價檢測。將待濃縮的病毒原液用連續離心機12000r/min，至少2次，然后將離心處理的病毒原液用0.45um濾膜過濾，以去除病毒液中的雜質和雜蛋白。其余病毒原液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%。

3.2.4重組禽流感病毒滅活疫苗原液中甲醛濃度的檢測

1）對照品溶液的制備：如被測樣品為油乳劑疫苗，取已標定的甲醛溶液適量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5mL于50mL量瓶中，加20%吐溫-80乙醇溶液10mL，加水至刻度，搖勻，既得。

2）供試品溶液的制備：油乳劑疫苗用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，用20%吐溫-80乙醇溶液10mL，分次洗滌吸管，洗液并入50mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜止分層，下層液如不澄清，過濾，棄去初濾液，取澄清續濾液，即得。

3）檢驗法：精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.5mL，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10.0mL，乙酰丙酮試液10.0mL，至60℃恒溫水浴15min，冷水冷卻5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波長處測定吸收度，計算即得。

3.2.5判定標準表

1）甲醛溶液含量（含40%甲醛）應不超0.2%。甲醛溶液稱取量（w甲醛溶液）：0.2579g，甲醛溶液含量：37.10%。

2）對照品溶液吸收度（A對照品）：0.63L

3）吸收度（A供試品）：供試品1為0.22L，供試品2為0.224L。

4）計算公式：甲醛溶液（40%）含量%（g/mL）=0.25×A供試品/A1.0mg

A1.0mg=A對照品×100/W甲醛溶液×1000×甲醛溶液含量

3.2.6重組禽流感病毒滅活疫苗免疫效果的檢驗 主要用檢驗用材料：24日齡SPF雞、禽流感病毒H5亞型二價抗原批號201501來源哈獸研、重組禽流感病毒滅活疫苗（H5亞型二價）

1）檢驗方法：用24日齡SPF雞15只，其中10只雞每只肌肉注射疫苗0.3mL，5只雞不接種作為對照。接種后21d，分別采血，分離血清，用禽流感病毒H5亞型二價抗原測定HT抗體。

2）判定標準：免疫雞HT抗體平均滴度（GMP）應≥6log2，對照雞均應為陰性。

4.結果

最后，傳統滅活疫苗產品（按《規程》規定生產）保存15個月后，其效價下降明顯，已不能達到《規程》的要求，說明傳統滅活疫苗產品保存期僅為12個月，新的滅活疫苗產在保存期18個月后，用其免疫雞只，其效價仍能達到《規程》要求.試驗結果說明，相比于傳統滅活工藝的滅活疫苗產品，新的滅活工藝的滅活疫苗產品的保存期有顯著的延長。

5.討論

新的滅活工藝也是按照SOP標準規程的滅活方法加入0.2%的滅活劑（甲醛）進行滅活，但不同之處是在于在加入滅活劑前制備的病毒液要通過過濾離心設備進行雜質及雜蛋白的去除。這樣做的優點是為病毒濃縮做好基礎，使濃縮時的病毒液可以純凈無雜質，防止濃縮儀的膜包堵塞影響濃縮效果。此外，在病毒液加入滅活劑后通過美國PALL公司的超濾濃縮設備及配套膜包進行病毒液的濃縮和甲醛的洗脫，這樣做的優點是有效地提高疫苗的抗體水平和降低病毒液中的甲醛濃度，新的滅活工藝并不是完全地改變傳統滅活，而是在其之上加入了更為優化的機器設備，控制好一切可能會影響滅活過程的環節，提升了疫苗品質的同時也降低了可能造成副反應的幾率。（編輯：蔡中梅）