淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠大腦皮質(zhì)DMT1表達(dá)的影響*

董賢慧，高維娟，賀小平，崔志超，柴錫慶，趙家晴

(1.承德醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，石家莊 050000;3.河北中醫(yī)學(xué)院心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000;4.中國(guó)人民解放軍第266醫(yī)院骨科，河北承德 067000)

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淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠大腦皮質(zhì)DMT1表達(dá)的影響*

董賢慧1，高維娟3，賀小平4，崔志超4，柴錫慶2△，趙家晴1

(1.承德醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，石家莊 050000;3.河北中醫(yī)學(xué)院心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000;4.中國(guó)人民解放軍第266醫(yī)院骨科，河北承德 067000)

[摘要]目的探討淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默癥(AD)APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型大腦皮質(zhì)二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(DMT1)表達(dá)的影響。方法將APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠60只，分為模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組、去鐵胺(DFO)組，C57BL/6J小鼠作為健康對(duì)照組。用藥結(jié)束后，取各組小鼠腦組織，分別采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)DMT1的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：陰性對(duì)照未見(jiàn)DMT1陽(yáng)性細(xì)胞。與健康對(duì)照組相比，模型組DMT1的表達(dá)增高；與模型組相比，復(fù)方組和DFO組DMT1的表達(dá)降低(P<0.05)；DFO組與復(fù)方組DMT1的表達(dá)無(wú)明顯差異。RT-PCR結(jié)果、Western blot結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。結(jié)論淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以下調(diào)AD模型小鼠大腦皮質(zhì)DMT1的表達(dá)，從而抑制小鼠腦鐵超載，緩解鐵超載帶來(lái)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型；小鼠；淫羊藿；黃芪；葛根；二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種與年齡相關(guān)的以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)變性疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),AD患者的腦鐵水平異常升高，其機(jī)制可能與某些腦組織鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)失控相關(guān)[1]。細(xì)胞鐵代謝主要過(guò)程是鐵的攝取,二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)參與細(xì)胞Fe2+的攝取。根據(jù)DMT1 mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslationalregion,3′-UTR)是否帶有鐵反應(yīng)元件(iron-responseelemeni,IRE)，可將DMT1分為DMT1-IRE和DMT1-非IRE兩種異構(gòu)體，二者均定位于細(xì)胞膜和胞內(nèi)循環(huán)的內(nèi)吞小泡膜上，參與多種二價(jià)金屬離子尤其是鐵離子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，是維持細(xì)胞內(nèi)二價(jià)金屬離子穩(wěn)態(tài)的重要金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一[2]。

研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用去鐵胺(deferoxamine,DFO)等鐵螯合劑可以有效地緩解AD患者的病情發(fā)展[3]，但這些化學(xué)藥物都有一定不良反應(yīng)或口服困難等缺點(diǎn)，很難推廣應(yīng)用[4]。因此，本研究考慮采用中藥來(lái)治療AD。中醫(yī)認(rèn)為AD發(fā)病以腎虛精虧，氣血不足為本，痰瘀互結(jié)，濁毒內(nèi)生為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。本研究將淫羊藿、黃芪、葛根有效組分進(jìn)行組方，研究淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)AD模型小鼠大腦皮質(zhì)DMT1表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料選取SPF級(jí)雄性的APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠6個(gè)月齡60只，分為模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組，每組10只。另選6個(gè)月齡C57BL/6J小鼠10只作為健康對(duì)照組。全部動(dòng)物購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004，購(gòu)進(jìn)后進(jìn)行2周預(yù)飼養(yǎng)，分別單籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12/12的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。

1.2方法

1.2.1各組用藥方法淫羊藿組灌胃給予淫羊藿苷120 mg/kg，黃芪組灌胃給予黃芪甲苷80 mg/kg，葛根組灌胃給予葛根素80 mg/kg，復(fù)方組灌胃給予淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復(fù)方，淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，按成分按照比例3∶2∶2，以臨床3倍用藥量給藥，即淫羊藿苷120 mg/kg、黃芪甲苷80 mg/kg、葛根素80 mg/kg 體質(zhì)量給予小鼠灌胃,DFO組于小鼠大腿外側(cè)肌內(nèi)注射DFO 30 mg/kg。各組小鼠用藥處理1次/天，連續(xù)給藥3個(gè)月。模型組和健康對(duì)照組給予實(shí)驗(yàn)組等量生理鹽水灌胃。

1.2.2取材連續(xù)用藥3個(gè)月后，每組小鼠各取3只，10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳和心尖部，灌注針準(zhǔn)確經(jīng)左心室插到升主動(dòng)脈，固定灌注針，生理鹽水(含1 %肝素)灌注，直至右心耳流出的液體清亮，動(dòng)物四肢末端，肺臟，肝臟等均變白，更換0.1 mol/L，4 ℃，4 %的多聚甲醛溶液快速灌注，小鼠出現(xiàn)尾部及四肢痙攣抽搐，胃腸道脹氣，灌注約20 s后，降低灌注速度，持續(xù)20 min后灌注完畢。在4 ℃冰箱后固定2 h完整取出腦組織，4 %多聚甲醛，體外固定24 h，放入30%蔗糖溶液，沉淀組織在冷凍切片機(jī)-25 ℃下，20 μm連續(xù)切片，-20 ℃冰箱保存，留做免疫組織化學(xué)染色。各組其余7 只小鼠不灌注，直接取大腦皮質(zhì)，將大腦皮質(zhì)沿正中分左右兩部分，其中左側(cè)大腦皮質(zhì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)；右側(cè)大腦皮質(zhì)用于蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1的表達(dá)各組選取10張小鼠腦組織冰凍切片，46 ℃烤片2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)3 %的過(guò)氧化氫處理，山羊血清封閉；滴加兔抗小鼠DMT1-IRE/DMT1-非IRE(20 μg/mL;Alpha Diagnostics,Owings Mills,MD,美國(guó))，利用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加抗兔生物素化二抗(Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems,ZSGB-BIO,北京)，37 ℃孵育15 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈親和素，37 ℃孵育15 min；DAB顯色；復(fù)染、脫水、透明、封固。顯微鏡下進(jìn)行觀察。以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞核棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片分別取5個(gè)視野(×400)，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1 mRNA的表達(dá)取各組小鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)，Trizol法抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)(Beckman Coulter,Inc.250 S.Kraemer Boulevard Brea,CA 92821,美國(guó))檢測(cè)吸光度(A)260/280，并計(jì)算其純度和濃度。按照用于RT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen,Prom-Test LLC,Koghbatsi 28/69,0014,Yerevan,亞美尼亞)，取1 μg總RNA樣本，加入Oligo(dT)20 1 μL，10 mmol/L dNTP混合物1 μL，5×緩沖液2 μL，無(wú)RNase水至10 μL。65 ℃變性5 min，置于冰上冷卻，短暫離心，加入PrimeScript RT Enzyme 2 μL，0.1 mol/L DTT 1 mL，混勻，37 ℃孵育2 min。加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，吹打混勻，37 ℃孵育5 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。根據(jù)DMT1基因在GenBank的序列，經(jīng)Primer Express5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由Invitrogen公司合成,見(jiàn)表1。

表1　基因引物序列

應(yīng)用帶有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen,Prom-Test LLC,Koghbatsi 28/69,0014,Yerevan,亞美尼亞)RT-PCR試劑盒，以5倍稀釋5個(gè)濃度梯度的cDNA樣本，分別建立目的基因與β-actin基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定它們的擴(kuò)增效率。反應(yīng)體系25 μL包括：SYBR Ex Taq 12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA (10 μmol/L)0.5 μL，ddH2O 11 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束后采集熒光。為確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線的分析，條件如下：65～95 ℃，每5 s上升0.5 ℃。每組樣品設(shè)定無(wú)cDNA模板反應(yīng)孔為陰性對(duì)照，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，重復(fù)間允許差異小于0.5 Ct。用BioRad ManagerTM軟件(Bio-Rad Laboratories,Philadelphia,亞美尼亞)測(cè)定每個(gè)樣本的相對(duì)拷貝數(shù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組樣品-ΔCt對(duì)照組樣品，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.2.5Western blot檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)DMT1-IRE/DMT1-非IRE蛋白的表達(dá)取小鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)，提取總蛋白，按BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白按照50 μg上樣量加入凝膠，電泳1.5 h，隨后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛奶封閉2 h，置于含有兔抗β-Actin(1∶5 000;杭州華安生物技術(shù)有限公司，杭州)、兔抗大鼠DMT1-非IRE(1∶3 000;Alpha Diagnostics,Owings Mills,MD,美國(guó))、兔抗大鼠DMT1-without IRE(1∶2 000;Alpha Diagnostics,Owings Mills,MD,美國(guó))一抗的稀釋液中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，每次15 min，滴加相應(yīng)抗兔二抗(1∶10 000;KPL,Gaithersburg,Maryland,美國(guó))，室溫孵育2 h，繼續(xù)0.05%TBST清洗3次，光化學(xué)顯色法檢測(cè)DMT1-IRE/DMT1-非IRE蛋白的表達(dá)。以β-Actin為內(nèi)參，采用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,Philadelphia,亞美尼亞)分析蛋白條帶的光密度(OD)值，以目的蛋白與β-Actin蛋白光密度的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)染色顯示，與健康對(duì)照組比較，模型組DMT1的表達(dá)增高(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組DMT1的表達(dá)降低(P<0.05)；與DFO組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組DMT1的表達(dá)增高(P<0.05);DFO組與復(fù)方組DMT1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，箭頭所指為陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

1：陰性對(duì)照；2：健康對(duì)照組；3：模型組；4：淫羊藿組；5：黃芪組；6：葛根組；7：復(fù)方組；8：DFO組。a:P<0.05，與健康對(duì)照組比較；b:P<0.05，與模型組比較；c:P<0.05，與淫羊藿組比較；d:P<0.05，與黃芪組比較；e:P<0.05，與葛根組比較。

圖1淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)各組小鼠大腦皮質(zhì)DMT1-IRE/DMT1-非IRE表達(dá)的影響(×200)

1:健康對(duì)照組；2:模型組；3:淫羊藿組；4:黃芪組；5:葛根組；6:復(fù)方組；7:DFO組。a:P<0.05，與健康對(duì)照組比較；b:P<0.05，與模型組比較；c:P<0.05，與淫羊藿組比較；d:P<0.05，與黃芪組比較；e:P<0.05，與葛根組比較。

圖2淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)各組小鼠

大腦皮質(zhì)DMT1 mRNA表達(dá)的影響

2.2淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果表明，與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，與DFO組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組DMT1 mRNA的表達(dá)增高(P<0.05)；DFO組與復(fù)方組DMT1 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

1：健康對(duì)照組；2：模型組；3：淫羊藿組；4：黃芪組；5：葛根組；6：復(fù)方組；7：DFO組。a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與淫羊藿組比較；d：P<0.05，與黃芪組比較；e：P<0.05，與葛根組比較。

圖3淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)各組小鼠大腦皮質(zhì)

DMT1-IRE/DMT1-非IRE蛋白表達(dá)的影響

2.3淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1-IRE/DMT1-非IRE表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明，與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1-IRE/DMT1-非IRE的表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1-IRE/DMT1-非IRE的表達(dá)降低(P<0.05)；與DFO組比較，淫羊藿組、黃芪組、葛根組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1-IRE/DMT1-非IRE的表達(dá)增加(P<0.05)，DFO組與復(fù)方組小鼠大腦皮質(zhì)中DMT1-IRE/DMT1-非IRE的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。

3討論

AD是常見(jiàn)的老年人慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前其病因、發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，很大程度上制約了AD治療藥物的篩選。

建立動(dòng)物模型的目的是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上復(fù)制人類疾病的模型，用于研究人類疾病的病因、發(fā)病、病理變化以及疾病的預(yù)防和治療。AD的病因是多元性的，遺傳因素是其中的一個(gè)重要因素[5]。AD病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型種類繁多，包括單轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，像PDAPP小鼠[6]、Tg2576[7]、APP23[8]、PS轉(zhuǎn)基因小鼠等；雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，像APPswe/PS1M146L、APPSL/PS1M146L[9]、APPSL/PS1kI、APP KM670/671NL/APP V717F[10]、APP/apoE等；還包括多重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，如APP/PS1/tau[11]、Cdk5/P35/tau[12]等。而目前應(yīng)用最為廣泛的為APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該模型是野生型C57BL/6J小鼠PS1基因E9缺失，不是滅活作用，促使其功能加強(qiáng)，是國(guó)際公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源于C57BL/6J小鼠，所以本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL/6J小鼠為健康對(duì)照組[13]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦鐵水平異常升高，異常增高的腦鐵啟動(dòng)機(jī)體級(jí)聯(lián)放大機(jī)制，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，在AD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。AD患者腦組織鐵含量增高可能與某些腦組織鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)失控相關(guān)。DMT1是重要的腦組織攝鐵相關(guān)蛋白，屬于自然抵抗相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白家族，其表達(dá)異常可能是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的重要原因，DMT1與AD的關(guān)系至今尚不完全清楚。有研究表明，老齡大鼠腦內(nèi)DMT1表達(dá)呈年齡性增高趨勢(shì)，多種炎癥因子也能使DMT1在腦內(nèi)表達(dá)上調(diào)，這兩種情況均是誘發(fā)AD的重要危險(xiǎn)因素。然而，有關(guān)DMT1與AD發(fā)病機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究表明，應(yīng)用DFO等鐵螯合劑均顯著緩解了AD患者的病情發(fā)展，但這些化學(xué)藥物都有一定不良反應(yīng)或口服困難等缺點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療原則，將淫羊藿、黃芪、葛根有效組分進(jìn)行組方，其中淫羊藿歸肝、腎經(jīng)，具補(bǔ)腎填精、生精養(yǎng)髓之功效，為君藥；黃芪歸肺、脾經(jīng)，為補(bǔ)氣圣藥，具補(bǔ)氣健脾、行血化瘀之功效，為臣藥；葛根歸脾、胃經(jīng)，具清熱、降火、排毒之功效，亦可升舉清陽(yáng)，引諸藥上達(dá)于頭目，為佐藥。三藥合用，共起滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)脾養(yǎng)血、活血化瘀、清熱解毒、健腦益智之功效，符合AD的中醫(yī)治療理論。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者在服用黃芪、淫羊藿、葛根等中藥3個(gè)月后，其智力和記憶力得到有效提升，日常生活自理能力也有所增強(qiáng)，且治療中未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以有效下調(diào)AD小鼠大腦皮質(zhì)DMT1的表達(dá)，從而抑制小鼠腦鐵超載，緩解鐵超載帶來(lái)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退，為開(kāi)發(fā)治療AD的新藥提供新的思路和策略。

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Effects of effective fraction of Epimedium,Astragalus,Radix Puerariae on the expression of DMT1 in the cerebral cortex of transgenic mice model of Alzheimer′s disease*

Dong Xianhui1,Gao Weijuan3,He Xiaoping4,Cui Zhichao4,Chai Xiqing2△,Zhao Jiaqing1

(1.DepartmentofHumanAnatomy,ChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China;2.DepartmentofPharmaceuticalEngineering，HebeiChemcialandPharmaceutialCollege,Shijiazhuang,Hebei050000,China;3.KeyLaboratoryofCardiocerebrovascularDiseasePreventionandControlbyChineseMedicine，HebeiCollegeofTranditionalChineseMedicine,Shijiazhuang,Hebei050000,China;4.DepartmentofOrthopaedic,the266stHospitalofPLA,Chengde,Hebei067000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Epimedium,Astragalus,Radix Puerariae on DMT1 expression in the cerebral cortex of APPswe/PS1ΔE9double transgenic mice model of AD.MethodsA total of 60 specific-pathogen-free male APPswe/PS1ΔE9double transgenic mice aged 6 months were equally and randomly assigned to model,Epimedium,Astragalus,Radix puerariae,compound and DFO groups.An additional 10 6-month-old C57BL/6J mice served as negative control group.Using immunohistochemistry and molecular biology methods to investigate the effects of a compound combining the effective components of Epimedium,Astragalus,Radix puerariae on DMT1 expression in the cerebral cortex of APPswe/PS1ΔE9double transgenic mice model of AD.ResultsImmunohistochemical staining results revealed that DMT1 positive cell did not show in negative control group.DMT1 expression was higher in model group compared with the negative control group.DMT1 expression was lower in the compound and deferoxamine groups than in the model group.No significant difference was detected in DMT1 expression between deferoxamine and compound groups.RT-PCR,Western blot and immunohistochemical staining results showed no significant difference.ConclusionThese compounds can downregulate DMT1 expression and inhibit iron overload in the cerebral cortex of mice with Alzheimer′s disease,reduce iron overload induced impairment of the central nervous system.

[Key words]Alzheimer disease;transgenic animal model;mice;epimedium;Astragalus;Radix Puerariae;divalent metal transporter 1

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.006

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273983)；河北省食品藥品監(jiān)督管理局資助項(xiàng)目(PT2014053)；河北省教育廳青年基金項(xiàng)目(QN2015205)；河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(2015152);河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(20160008)；河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；承德市科技局資助項(xiàng)目(201601A022)。

作者簡(jiǎn)介：董賢慧(1983-)，博士，講師，主要從事中藥對(duì)阿爾茨海默病腦鐵代謝的作用機(jī)制研究。△通訊作者，Tel：(0311)85110002；E-mail:xqchai@163.com。

[中圖分類號(hào)]R322.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)16-2176-04

(收稿日期：2015-12-04修回日期：2016-01-17)