阿爾茨海默病大鼠模型建立及葛根素對大鼠空間學習記憶的影響*

李　冬，田　寅，宮　宇，王　曦

(佳木斯大學附屬第一醫院：1.藥劑科；2.腫瘤外科,黑龍江佳木斯 154007)

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阿爾茨海默病大鼠模型建立及葛根素對大鼠空間學習記憶的影響*

李冬1，田寅2△，宮宇1，王曦1

(佳木斯大學附屬第一醫院：1.藥劑科；2.腫瘤外科,黑龍江佳木斯 154007)

[摘要]目的探討葛根素對β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)誘導的阿爾茨海默病(AD)大鼠空間學習記憶障礙的影響。方法采用雙側海馬注射Aβ1-42誘導AD大鼠模型。造模后3 d起，葛根素按不同劑量灌胃給藥28 d，給藥結束后采用Morris水迷宮測試系統，檢測大鼠空間學習記憶能力。結果模型組大鼠表現出明顯的學習記憶能力障礙，而葛根素高、中、低劑量組干預則顯著地改善了AD大鼠學習記憶能力。結論葛根素能部分的提高AD模型大鼠的空間學習記憶能力。

[關鍵詞]阿爾茨海默病；葛根素；空間學習記憶

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿的中樞神經系統退行性疾病，其主要臨床表現為嚴重的不可逆轉、漸進性的認知功能障礙和精神異常[1-2]。AD發病初期，會出現近期記憶出現缺失，保存遠期的記憶和高級學習記憶[3-4]。之后，記憶缺失進展為遠期記憶及其他認知和行為功能缺失，認知功能下降、進行技巧工作及理解力損害、語言和視空間反常，計算能力下降[5-7]。本研究以逃避潛伏期和過臺次數為指標，通過Morris水迷宮檢測葛根素對AD大鼠空間學習記憶的影響，為AD的研究提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組將成年健康雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g(佳木斯大學實驗動物中心)分為6組，即假手術組、模型對照組、鹽酸多奈哌齊對照組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組、葛根素高劑量組，每組各10只。

1.1.2實驗儀器腦立體定位儀(江灣一型C，第二軍醫大學)；微量進樣器(上海精密激光儀器廠)；電子天平(AE-240型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；超低溫冰箱(MDF-492，日本三洋公司)；電冰箱(BCD-243型，中國康拜恩電冰箱總廠)；壓力蒸汽滅菌器(ZDX-35SB，上海申安醫療器械廠)； PURELAB PLUS超純水系統(美國波爾公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(101-1AB，天津泰思特儀器有限公司)。

1.1.3藥品及試劑葛根素純粉劑(南京正大天晴制藥有限公司)；鹽酸多諾哌齊片(貴州圣濟堂制藥)；Aβ1-42(Sigma公司)；無水乙醇注射液(天津市凱通化學試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1AD大鼠模型的建立[8]大鼠適應性飼養7 d，術前12 h禁食不禁水，進行造模。SD大鼠經戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀，顱頂區備皮，消毒，沿頭頂中線部位作約2 cm的切口，將骨膜分離使其頭骨暴露，從前鹵向后約3.0 mm，從中線左、右兩旁開2.0 mm處，將用牙科鉆打開顱骨。用微量進樣器垂直進針2.8 mm，將10 μg/μL β-淀粉樣蛋白Ⅰ(Aβ1-42)溶液在5 min內緩慢注入，留針5 min后緩慢撤針，再用牙科泥封堵住顱骨，消毒并縫合皮膚。假手術組注射與1 μL 0.9%生理鹽水注射液，其余操作同前。以假手術組平均逃避潛伏期作為參考值，用每支大鼠的逃避潛伏期與參考值只差占該大鼠的逃避潛伏期的比值來判定判定AD大鼠模型的建立是否成功，該比值大于20認為造模成功，造模不成功的大鼠不列入數據計算。

1.2.2動物給藥治療動物造模3 d后開始灌胃給藥治療。葛根素低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg/kg給藥，鹽酸多奈哌齊對照組用鹽酸多奈哌齊溶液灌胃治療(按0.33 mg/kg給藥)，假手術組與模型對照組用相同體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，共給藥28 d。

1.2.3Morris水迷宮測試[9]預先在水池里注入清水，水溫控制在26 ℃左右，加入奶粉使其成為不透明的乳白色水溶液，再將適量的清水注入，使水面略高于平臺，水深在30 cm左右。實驗開始前1 d將大鼠分別放入沒有平臺的水迷宮內，每只鼠

表1　定位航行實驗各組大鼠平均逃避潛伏期±s，s)

*：P<0.05，與模型組比較。

自由游泳2 min，使其適應游泳環境，將大鼠頭部染成黑色。實驗歷時7 d，每次訓練限時1 min。測試開始時沿水池中部的池壁將大鼠緩慢的放入池中，大鼠需面對池壁入水。記錄大鼠從入水點入水后在1 min內找到平臺的時間，若大鼠在1 min內沒能找到平臺，就人工把大鼠置于平臺上并使其在上面停留30 s，結束1次訓練。實驗過程中水池周圍的參照物位置保持不變。連續實驗6 d，實驗的第7天，撤掉安全平臺開始測試大鼠對平臺空間位置記憶的能力。與前6 d測試步驟相同，記錄大鼠尋找記憶中的平臺所花費的時間。將大鼠第1次經過平臺的時間(潛伏期)和每只大鼠在1 min內經過平臺的次數分別記錄。

2結果

2.1定位航行實驗結果定位航行實驗結果顯示，在6 d的實驗中，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體呈下降趨勢，說明大鼠經過多次訓練，對平臺的記憶能力增加，但是各組大鼠的學習記憶能力有所不同。采用重復測量多因素方差分析結果顯示：在不同時間大鼠逃避潛伏期差異有統計學意義[F(5，105)=141.225，P<0.05]，以時間為主效應，差異有統計學意義[F(25，525)=3 921.016，P<0.05]。各時間點和不同組別之間存在交互效應[F(30，535)=12.806，P<0.05]。表明模型組大鼠學習獲取能力較差，而葛根素能改善模型大鼠的學習障礙。比較不同時間段各指數之間的差異，第1天各組大鼠逃避潛伏期無明顯差異，第2～6天，模型組大鼠平均逃避潛伏期較假手術組明顯延長(P<0.05)；葛根素組和鹽酸多奈哌齊組大鼠平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2空間探索實驗結果在空間探索實驗中，與假手術組比較，模型組跨越原平臺的次數明顯減少，而葛根素低劑量、中劑量、高劑量組大鼠跨越原平臺的次數明顯增多。鹽酸多奈哌齊與葛根素效應相當，見表2。

表2　各組大鼠跨越原平臺的次數比較±s)

*：P<0.05，與模型組比較。

3討論

迷宮是檢測大鼠空間學習記憶能力的裝置，本研究先對動物進行某種訓練，經過一定的時間后，測其保存量以衡量其記憶。游出時間及錯誤次數反映了動物的學習記憶能力。實驗中，經過反復訓練動物，同時記錄動物尋找平臺的時間來評價其學習能力，動物尋找平臺的時間越短，說明動物學習能力越強。撤掉平臺后，通過檢測動物經過原平臺所在位置的次數來評價動物對于訓練的記憶能力。給藥結束后，將6組實驗動物分別進行訓練和測試，增加訓練的次數，各組平均尋找平臺的時間呈逐漸縮短趨勢。這表明大鼠通過多次訓練，尋找平臺的能力增加。但Aβ1-42注射所致AD大鼠模型組學習記憶能力明顯低于假手術組，表明腦內注射Aβ1-42制備的動物模型記憶能力明顯的下降，動物具有類似“癡呆”表現，表明AD模型制備成功。而葛根素組與多奈哌齊組的潛伏期明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。表明葛根素和多奈哌齊對Aβ1-42誘導的AD大鼠模型的學習記憶缺失具有明顯的改善功能。實驗結果還顯示，葛根素組對AD大鼠學習記憶能力的改善作用與假手術組相比還具有一定的差距，表明葛根素只能部分的提高AD模型大鼠的學習記憶能力，卻不能徹底的治愈。

參考文獻

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The construction of Alzheimer′s disease rats model and the effects of puerarin on rat spatial learning and memory*

Li Dong1,Tian Yin1△,Gong Yu2,Wang Xi1

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofSurgicalOncology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi,Heilongjiang154002,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the effects of puerarin on Alzheimer′s disease(AD) rats spatial learning and memory disorder induced by Aβ1-42.MethodsBilateral hippocampal injection of Aβ1-42 was used to induced AD model rats.All rats underwent gavage administration with puerarin with different dose for 28 d since the 3rd day after the construction of model;and the Morris water maze was used to test the spatial learning and memory ability of rats.ResultsThe model group rats showed obvious learning and memory disorder,and the ability of learning and memory disorder of rats in the high,medium and low dose of puerarin intervention group were significantly improved.ConclusionPuerarin can improve the spatial learning and memory ability of AD model rats.

[Key words]Alzheimer disease;puerarin;spatial learning and memory

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.007

*基金項目：佳木斯大學青年基金項目(Sq2013-021)。

作者簡介：李冬(1982-)，主管藥師,碩士，主要從事臨床藥學、天然藥化研究。△通訊作者,Tel:15694549965；E-mail:dongdong_3333@163.com。

[中圖分類號]R965.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2180-02

(收稿日期：2015-12-25修回日期：2016-03-01)