siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因對支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌增殖的影響

王　濤,韓　娜

(河北大學附屬醫院(北院)肺二科,河北保定 071000)

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siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因對支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌增殖的影響

王濤,韓娜△

(河北大學附屬醫院(北院)肺二科,河北保定 071000)

[摘要]目的探討siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因對支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌增殖的影響。方法將20只雌性BALB/c小鼠分為實驗組和對照組，實驗組構建哮喘模型，取氣管和支氣管進行細胞培養。對實驗組和對照組培養的氣道壁平滑肌細胞分別進行分組：磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(加入PBS)、錯義鏈對照組(轉染錯義鏈)和siRNA轉染組(轉染siRNA Survivin)，檢測氣道壁平滑肌細胞中Survivin基因、Survivin蛋白和caspase-9蛋白表達，檢測細胞上清液中IL-6和人趨化因子(CCL5)水平。結果RT-PCR結果顯示，實驗組中siRNA轉染組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin RNA相對表達量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，氣道壁平滑肌細胞中 Survivin蛋白表達量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，而caspase-9蛋白表達量則高于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；實驗組中siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS對照組和錯義鏈對照組；2～4 d細胞增殖量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組；氣道壁平滑肌細胞G0/G1期比例高于PBS對照組和錯義鏈對照組，而S/G2期比例則低于PBS對照組和錯義鏈對照組，細胞凋亡率則高于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論siRNA特異性沉默Survivin基因，可加速氣道壁平滑肌細胞凋亡，有效抑制細胞異常增殖及分泌功能。

[關鍵詞]支氣管哮喘；Survivin；氣道平滑肌細胞；增殖

支氣管哮喘是呼吸科常見的氣道慢性炎癥性疾病，病理過程復雜，研究認為[1]，氣道慢性炎癥誘發氣道重塑是其發病的重要病理基礎。氣道重塑過程主要涉及慢性炎癥所致氣道壁平滑肌細胞大量增殖和細胞外基質沉積，其中，平滑肌細胞大量增殖在氣道重塑中尤為重要[2]，如何有效抑制平滑肌細胞增殖及表型轉化，有望為支氣管哮喘治療提供新的契機。存活蛋白(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族中抑制凋亡作用最強的蛋白，可通過抑制caspase激活而對細胞凋亡起負向調控，在細胞異常增殖及惡性轉化中發揮重要作用[3]。已有研究表明[4]，Survivin參與并調控腫瘤細胞異常增殖、凋亡過程。但其在氣道平滑肌細胞增殖中的作用鮮有報道。本研究嘗試采用小干擾RNA(siRNA)靶向沉默Survivin基因，通過改變Survivin基因表達觀察其對氣道平滑肌細胞生物學行為的影響，以期為支氣管哮喘基因靶向治療提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料標準胎牛血清和鼠抗平滑肌α肌動蛋白單克隆抗體均購自購自美國Sigma公司，胰蛋白酶液、DMEM高糖培養基和DMEM培養液均購自Thermo公司，Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和Liposuction 2000脂質體轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，SP免疫組織化學試劑盒購自北京欣興唐生物科技有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體試劑盒和兔抗人caspase-9多克隆抗體均購自福州邁新公司，細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒均購自美國Bestbio公司，小鼠IL-6和人趨化因子(CCL5/Rantes)檢測試劑盒均購自上海豐壽生物科技有限公司，siRNA Survivin、陽性對照GAPDH-siRNA、陰性對照錯義鏈均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組20只4～6周齡雌性BALB/c小鼠由河南省實驗動物中心提供，體質量15～18 g，飼養于標準條件下(溫度23 ℃左右、相對濕度50%～60%)，自由飲水及攝食。利用隨機數字表隨機分為實驗組和對照組，每組10只。

1.2.2小鼠哮喘模型的構建及處理參考文獻[5]方法構建小鼠哮喘模型，實驗組：第1天將10%卵清清蛋白和10%氫氧化鋁抗原溶液0.2 mL進行腹腔注射致敏，14 d后進行超聲霧化吸入2.5%卵清清蛋白30 min左右誘發哮喘，等待小鼠出現嗆咳、呼吸急促、煩躁、發紺等哮喘發作癥狀，每間隔1 d進行1次，連續進行42 d。對照組：第1天將生理鹽水進行腹腔注射，后續處理與實驗組相同，僅將生理鹽水替換卵清清蛋白。所有小鼠在最后1次霧化處理后1 d進行頸椎脫臼處死，取氣管和支氣管進行細胞培養，對右肺中葉進行免疫組織化學染色。利用組織貼塊法對小鼠氣道壁平滑肌細胞進行培養，取培養第5代細胞進行后續實驗處理。

1.2.3小鼠氣道壁平滑肌細胞分組及處理對實驗組和對照組培養的氣道壁平滑肌細胞分別進行分組：磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(加入PBS)、錯義鏈對照組(轉染錯義鏈)和siRNA轉染組(轉染siRNA Survivin)，根據Survivin基因序列及siRNA設計原則，確定最佳的siRNA Survivin序列：GCA TTC GTC CGG TTG CGC T。將等量的1×106氣道壁平滑肌細胞加入到6孔培養板中，放置到37 ℃恒溫箱中培養，待細胞生長達到70%～80%融合時，將培養基換成不含血清DMEM行過夜培養。次日進行轉染，嚴格按照試劑說明書進行操作，讓siRNA最終濃度保持在30 nmol/L，混勻后，放置在37 ℃恒溫箱培養，46 h后開始下面的使用。

1.2.4利用逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測氣道壁平滑肌細胞中Survivin mRNA表達利用Trizol總RNA提取試劑盒對細胞中總RNA進行提取，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄為cDNA。以獲得的cDNA為模板進行PCR，Survivin引物序列為，上游：5′-ACG GGG GAG AGA CGC AGT CC-3′，下游：5′-GAC CGA GAC CGG GAC CTG GA-3′，以GAPDH作為內參，PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性 20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，連續進行36個循環。對獲得的PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用Multi Gauge V3.1軟件對獲得的電泳圖像進行分析獲得Survivin mRNA相對表達量。

1.2.5利用蛋白免疫印跡法(Western blot)對氣道壁平滑肌細胞中Survivin和caspase-9蛋白表達量提取培養氣道壁平滑肌細胞中總蛋白，于4 ℃下3 500 r/min離心15 min，取上清液，保存于-20 ℃冰箱。利用BCA蛋白定量試劑盒對獲得的蛋白濃度進行檢測，取50 μg蛋白進行十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并電轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉進行封閉120 min，分別將一抗Survivin(1∶1 000)、caspase-9(1∶500)及內參加入后，4 ℃過夜，將二抗加入，利用雙色紅外熒光掃描系統對結果進行檢測，計算蛋白相對量。

1.2.6采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測IL-6和CCL5水平取處理后48 h的氣道壁平滑肌細胞上清液，利用ELISA法對IL-6和CCL5水平進行檢測。

1.2.7四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法對細胞增殖情況進行檢測取對數期生長的氣道壁平滑肌細胞，將200 μL約含5 000個細胞接種于培養板，分別在培養2、3和4 d后終止培養，每次終止培養前4 h，將20 μL 5 mg/mL的MTT溶液加入后，培養4 h，將培養基去除后，繼續往各孔加入200 μL DMSO，振蕩至結晶溶解，利用全自動酶標儀對各孔進行檢測。

1.2.8采用流式細胞儀對細胞凋亡情況及細胞周期進行檢測取對數期生長的氣道壁平滑肌細胞，消化后收集細胞，用4 ℃預冷PBS沖洗3次，利用結合緩沖液1 mL重新懸浮細胞(濃度1×106)，取細胞懸液100 μL計入流式管中，并加入20 μg/mL碘化丙啶(PI)10 μL，避光條件下放置20 min，利用流式細胞儀(購自美國Beckman Coulter公司)對細胞凋亡情況進行檢測。另取消化后細胞，用預冷的70%乙醇固定過夜后，離心，收集細胞，用PBS洗滌3次，以100 μg/mL加入RNase A，于37 ℃恒溫箱孵育25 min，加入PI 500 μL于4 ℃下避光25 min，利用流式細胞儀對細胞周期進行檢測。

2結果

2.1小鼠哮喘模型構建鑒定對照組小鼠在模型構建過程中均未出現飲食、行為、呼吸節律異常，實驗組小鼠在模型構建過程中出現了活動減少、呼吸節律不齊、急促、煩躁不安、四肢震顫、嗆咳等表現，嚴重的甚至出現點頭呼吸及口鼻紫紺。肺組織免疫組織化學顯示，對照組小鼠氣道上皮完整，未出現平滑肌增厚、炎性細胞浸潤等現象；實驗組小鼠氣道上皮細胞出現破壞、炎性細胞浸潤及平滑肌增厚等現象，提示構建小鼠哮喘模型成功，見圖1。

2.2不同處理組Survivin基因表達和caspase-9蛋白表達RT-PCR結果顯示，實驗組中PBS對照組和錯義鏈對照組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin RNA相對表達量均高于對照組中PBS對照組和siRNA轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin RNA相對表達量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。Western blot結果顯示，實驗組中PBS對照組和錯義鏈對照組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin蛋白表達量均高于對照組中PBS對照組和siRNA轉染組，而caspase-9蛋白表達量則低于對照組中PBS對照組和siRNA轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組小鼠氣道壁平滑肌細胞中 Survivin蛋白表達量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，而caspase-9蛋白表達量則高于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1～3。

A：對照組;B：實驗組。

圖1　免疫組織化學檢測小鼠哮喘模型肺組織

a：P<0.05，與PBS對照組相比；b：P<0.05，與錯義鏈對照組相比；c：P<0.05，與對照組相比。

圖1　RT-PCR檢測實驗組和對照組中Survivin基因表達

圖2　Western blot檢測實驗組和對照組中

2.3不同處理組對氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平的影響實驗組中PBS對照組、錯義鏈對照組和siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖3　Western blot檢測實驗組和對照組中

組別IL-6CCL5實驗組 PBS對照組539.7±26.8c337.4±27.2c 錯義鏈對照組522.8±19.7c318.6±21.5c siRNA轉染組369.8±43.9abc262.5±35.7abc對照組 PBS對照組207.8±23.5142.5±18.9 錯義鏈對照組196.5±20.4139.6±17.1 siRNA轉染組184.7±16.9135.9±15.8

a：P<0.05，與PBS對照組相比；b：P<0.05，與錯義鏈對照組相比；c：P<0.05，與對照組相比。

2.4不同處理組對氣道壁平滑肌細胞增殖的影響實驗組中PBS對照組、錯義鏈對照組和siRNA轉染組2～4 d細胞增殖量均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；實驗組中siRNA轉染組2～4 d細胞增殖量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　不同處理組對氣道壁平滑肌細胞增殖的影響±s)

a：P<0.05，與PBS對照組相比；b：P<0.05，與錯義鏈對照組相比；c：P<0.05，與對照組相比。

2.5不同處理組對氣道壁平滑肌細胞周期及細胞凋亡的影響實驗組中PBS對照組和錯義鏈對照組氣道壁平滑肌G0/G1期比例顯著低于對照組，而S/G2期比例則高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞G0/G1期比例高于PBS對照組和錯義鏈對照組，而S/G2期比例則低于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；實驗組中PBS對照組和錯義鏈對照組細胞凋亡率均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組細胞凋亡率則高于PBS對照組和錯義鏈對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4　不同處理組對氣道壁平滑肌細胞周期及細胞

a：P<0.05，與PBS對照組相比；b：P<0.05，與錯義鏈對照組相比；c：P<0.05，與對照組相比。

3討論

支氣管哮喘作為一種氣道炎癥、重塑、高反應性的慢性進展性疾病，氣道壁平滑肌細胞在氣道重塑過程中發揮重要作用，不僅體現在細胞本身大量增殖及肥大，而且出現表現改變，分泌細胞因子的能力增加，而細胞因子又會促進氣道壁平滑肌細胞增殖及分泌[5-6]。Survivin作為一種凋亡抑制蛋白，可結合細胞周期調控因子CDK4，激活CDK2/cyclin E，并使Rb發生磷酸化，加入細胞由G1期進入S期，同時，還可使CDK4結合復合物中釋放出p21WAF1/CIP1，通過與caspase作用而對Fas介導的細胞凋亡進行抑制，從而加速細胞的惡性轉化及異常增殖[7]。本研究有選擇性的利用RNA干擾引起Survivin基因沉默，觀察其對小鼠支氣管哮喘模型氣道壁平滑肌細胞增殖、凋亡及分泌功能的影響。

本研究參考有關文獻[5]進行支氣管哮喘小鼠模型構建，結果顯示，構建的模型可反應支氣管哮喘實際病理過程。本研究RT-PCR結果顯示，實驗組中PBS對照組和錯義鏈對照組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin RNA相對表達量均高于對照組中PBS對照組和siRNA轉染組(P<0.05)，說明在支氣管哮喘模型小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin基因呈高表達，從而抑制細胞凋亡而加速細胞增殖過程[8]，同時，實驗組中siRNA轉染組小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin RNA相對表達量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，說明在對Survivin基因有效抑制后，小鼠氣道壁平滑肌細胞中Survivin基因呈低表達，進一步提示Survivin與氣道壁平滑肌細胞異常增殖有關。Western blot結果進一步說明，Survivin蛋白在支氣管哮喘小鼠氣道壁平滑肌細胞中呈高表達，而其發揮生理作用可能通過與caspase-9蛋白相互作用而使細胞發生異常增殖[9]。

IL-6是重要的炎性因子，其水平升高可促使Th向Th2分化，而Th2功能亢進，則會加速支氣管哮喘病程進展[10]，CCL5則是Th1相關趨化因子，對嗜酸性粒細胞具有正向趨化作用，而嗜酸性粒細胞浸潤及數量與支氣管哮喘發作及病情嚴重程度關系密切[11]。本研究結果顯示，實驗組中PBS對照組、錯義鏈對照組和siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平均高于對照組(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，說明支氣管哮喘小鼠模型中IL-6和CCL5水平增加，這可能與氣道壁平滑肌細胞大量合成分泌IL-6和CCL5有關[12]，而抑制Survivin基因則可減少兩者的分泌，結合本研究結果，實驗組中siRNA轉染組2～4 d細胞增殖量均低于BS液對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，說明抑制Survivin基因可減少氣道壁平滑肌細胞，從而減少了IL-6和CCL5分泌。

本研究結果顯示，實驗組中siRNA轉染組2～4 d細胞增殖量均低于PBS對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組氣道壁平滑肌細胞G0/G1期比例高于PBS對照組和錯義鏈對照組，而S/G2期比例則低于PBS對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，實驗組中siRNA轉染組細胞凋亡率則高于PBS對照組和錯義鏈對照組(P<0.05)，說明抑制Survivin基因表達可有效抑制哮喘模型小鼠氣道壁平滑肌細胞異常增殖，并加速細胞凋亡的發生，提示Survivin介導的細胞凋亡通路在氣道壁平滑肌細胞異常增殖中發揮重要作用，特異性的對Survivin基因進行抑制可加速氣道壁平滑肌細胞凋亡，從而阻止支氣管哮喘發生的病理基礎產生[13]。

綜上所述，siRNA技術可特異性引起Survivin基因沉默，降低其在支氣管哮喘模型小鼠氣道壁平滑肌細胞中的表達，可加速氣道壁平滑肌細胞凋亡發生，有效抑制細胞異常增殖及分泌功能，有望為進一步開展體內實驗研究提供新的線索，并為支氣管哮喘的基因治療提供新的靶位。

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Effects of siRNA silencing of inhibitor of apoptosis protein gene on the proliferation of airway smooth muscle in bronchial asthma mice

Wang Tao,Han Na△

(TheSecondDepartmentofPulmonary,theAffiliatedHospital(NorthHospital)ofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of siRNA silencing of inhibitor of apoptosis protein gene on the proliferation of airway smooth muscle in bronchial asthma mice.MethodsTweenty female BALB/c mice were randomly divided into experimental group and control group.Mice in the experimental group were constructed asthma models.The trachea and bronchi were collected for cell culture.Respectively,the cultured airway smooth muscle cells in the experimental group and the control group were grouped:PBS control group (added to PBS solution),missense chain control group (transfected with missense chain) and siRNA transfection group (transfected with siRNA Survivin).The expressions of Survivin mRNA,Survivin protein and caspase-9 protein in airway smooth muscle cells were detected.The levels of IL-6 and CCL5 in cell supernatant were detected.ResultsRT-PCR results showed that,the relative expression levels of Survivin RNA of airway smooth muscle cells in the siRNA transfection group of the experimental group were lower than the PBS control group and missense chain group,the differences were statistically significant (P<0.05).Western blot results showed that,the expressions of Survivin proteins in the siRNA transfection group of the experimental group were lower than the PBS control group and missense chain control group,while the caspase-9 protein were higher,In the experimental group,the synthesis and secretion levels of IL-6 and CCL5 of airway smooth muscle cells in the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the cell proliferations at 2-4 d in the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the proportion of G0/G1phase in the siRNA transfection group were higher than the PBS control group and missense chain control group,but the proportion of S/G2phase were lower than the PBS control group and missense chain control group,cells apoptosis rates of the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionsiRNA specific silencing Survivin gene could accelerate the airway smooth muscle cell apoptosis,and inhibit cell abnormal proliferation and secretion.

[Key words]bronchial asthma;Survivin;airway smooth muscle cells;proliferation

作者簡介：王濤(1980-)，主治醫師，本科，主要從事哮喘工作的研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:13833212335;E-mail:694826581@qq.com。

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.009

[中圖分類號]R562.2+5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2186-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-02-26)