董酒大、小曲浸提液對釀酒微生物發(fā)酵產(chǎn)不飽和脂肪酸的影響

湯慶莉，劉　昕，吳天祥（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

?

董酒大、小曲浸提液對釀酒微生物發(fā)酵產(chǎn)不飽和脂肪酸的影響

湯慶莉，劉昕，吳天祥
（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

摘要：董酒小曲中添加了90多味豐富的中藥材，大曲中添加了40多味。分別以其為原料制備浸提液，作為酵母菌液態(tài)發(fā)酵的添加液，通過設(shè)立實驗組（添加小曲浸提液）和對照組（不添加小曲浸提液）進行實驗，30℃恒溫發(fā)酵10d，10d后取實驗組和對照組的發(fā)酵液分別進行甲酯化處理，隨后進行氣相色譜分析，測定溶液中肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸這5種不飽和脂肪酸的含量。實驗結(jié)果表明，實驗組中的5種不飽和脂肪酸的含量明顯比對照組高，說明董酒酒曲對發(fā)酵過程中的不飽和脂肪酸的形成有一定的貢獻作用。

關(guān)鍵詞：董酒；酒曲浸提液；釀酒微生物；液態(tài)發(fā)酵；不飽和脂肪酸；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-17；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160517.1018.001.html。

中國白酒有著悠久而深厚的歷史文化，中國老八大名酒中，董酒占有一席之地［1-4］。因其用來發(fā)酵釀造的大、小酒曲中總共添加了130多味中草藥而被稱為國密配方［5-6］。豐富的中藥材融入釀酒的酒曲自然帶來了許多豐富的成分。眾所周知，制曲工藝中結(jié)合中藥材也是我國傳統(tǒng)白酒制曲傳承的一大民族特色和科技大發(fā)明，其實現(xiàn)了中藥材藥用功效與白酒養(yǎng)生文化充分結(jié)合，實現(xiàn)藥食雙效的功用［7-9］。著名的醫(yī)學(xué)寶典《黃帝內(nèi)經(jīng)》曾提出了“不治已病治未病，不治已亂治未亂”的核心思想。許多古典引“百草入曲”已傳承至今，更是實現(xiàn)了藥食結(jié)合產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化、效益化的發(fā)展。董酒添加了130多味名貴中藥材制曲釀酒，是藥用功效與酒體充分融合的代表，堪稱傳統(tǒng)白酒中的“黃帝內(nèi)經(jīng)”［10］。

不飽和脂肪酸是人體所需的一類物質(zhì)，它對人體具有保健的功能，除一些食物中含有外，它也存在于白酒中，作為白酒中的微量成分及保健物質(zhì)存在［11-13］。

本研究主要是以大、小酒曲為原料來制備浸提液，把其添加到發(fā)酵液作為酵母菌的底物來進行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期10d，通過設(shè)立對照組，來比較大、小酒曲浸提液對酵母菌在發(fā)酵過程中形成微量物質(zhì)不飽和脂肪酸含量的影響作用，進一步說明酒曲中添加了中草藥，在一定程度上對某些物質(zhì)的形成具有貢獻作用。

1材料與方法

1.1材料

大、小酒曲：貴州董酒股份有限公司提供。

酵母菌XJ-4、DJ-5：分別從董酒小、大酒曲中分離篩選而得。

菌株活化培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20%，蛋白胨20%，酵母膏10%，水1000mL，121℃滅菌20min。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱、小麥粉碎后按高粱∶小麥∶麩皮=8∶1∶1的比例混勻，90℃下水浴糊化90min，冷卻到60℃，按5 g α-淀粉酶∶100 g混合物的比例添加，液化1h。再按5 g糖化酶∶100 g混合物的比例添加酶活力為105 U/g的糖化酶，糖化1h，冷卻至室溫，用4層紗布過濾，收集濾液分裝后，121℃滅菌20min。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化

將分別保存在4℃冰箱中的斜面試管酵母菌DJ-5、XJ-4菌株，接入YPD培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，共活化2次。

1.2.2種子液培養(yǎng)

在分別裝有100mL各種種子液培養(yǎng)基的250mL三角瓶中對應(yīng)地接入2環(huán)已活化好的相應(yīng)菌種，細菌種子液于30℃、180r/min條件下培養(yǎng)24h備用，酵母菌種子液于30℃、180r/min條件下培養(yǎng)48h備用。霉菌種子液于30℃、180r/min條件下培養(yǎng)48h備用。

1.2.3浸提液的制備及成分分析

分別稱取10 g小酒曲于250mL干燥的圓底燒瓶中，用100mL的75%vol乙醇浸提。封口靜置48h，過濾減壓蒸去乙醇，再加入100mL的蒸餾水重溶，過濾。1 g酒曲可得10mL醇提液。醇提液用于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，其成分分析送至貴州省中科院藥用植物園質(zhì)譜室GC-MS分析完成。

離子流譜圖分析方法：對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進行檢索，確定成分。并且用峰面積歸一法來計算各成分的相對百分含量，以此來定性。

1.2.4搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

在裝有90mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基和10mL浸提液（大、小酒曲浸提液分別添加，設(shè)置為不同的實驗組）的250mL三角瓶中，空白組為不添加浸提液的100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基。分別將各種種子液以5%的接種量接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別貼上標(biāo)簽，置于恒溫30℃、180r/min條件培養(yǎng)10d，每天取發(fā)酵液測定其不飽和脂肪酸含量。

1.2.5發(fā)酵液甲酯化處理

取發(fā)酵液10mL于25mL具塞試管中，加入甲醇2mL，濃硫酸2滴，60℃水浴酯化30min。冷卻后轉(zhuǎn)入30mL分液漏斗中，依次加入5mL正己烷，2mL飽和NaCl，振蕩1min，靜置分層后收集有機相于25mL容量瓶中，水相連續(xù)用正己烷萃取2次，分別收集有機相于容量瓶中，定容后用于氣相色譜（GC）進樣分析。

1.2.6標(biāo)品對照品儲備液的配制

分別稱取肉豆蔻油酸甲酯、棕櫚油酸甲酯各100 mg，油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯60 mg、88 mg、70 mg 于10mL的棕色容量瓶中，用正己烷定容，分別配成不同濃度的單標(biāo)溶液。用封口膜密封置于-20℃冰箱冷凍儲存。

1.2.7外標(biāo)法標(biāo)品對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用正己烷分別配制10 mg/L的5種不飽和脂肪酸甲酯的單標(biāo)溶液。再配制100 mg/L的混標(biāo)溶液。通過單點對照定性定量。初步估算發(fā)酵液中的各不飽和脂肪酸含量，然后分別配制出各自相應(yīng)濃度的6個梯度混標(biāo)溶液。氣相色譜重復(fù)進樣3次不同濃度梯度的混標(biāo)溶液。以濃度和峰面積分別為橫、縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 RSD及回收率實驗

測定了3個濃度梯度溶液的回收率（回收率=加標(biāo)后測定濃度-空白濃度）/加標(biāo)量濃度×100%），空白組不加標(biāo)。平行進樣3次求其平均值，并計算RSD，以此評價方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1.2.9氣相色譜條件

KB-FFAP毛細管色譜柱（30m×0.32 mm×0.25μm）；Agilent 7890氣相色譜儀柱箱程序升溫條件35℃（5min）→7℃/min→100℃（2min）→10℃/min→220℃（4min），載氣（N2）流速：0.4mL/min；H2流速40mL/min；空氣流速400mL/min；尾吹：30mL/min；分流比：35∶1；進樣口溫度：240℃，F(xiàn)ID檢測器溫度為260℃；進樣量1.0μL。

2結(jié)果與討論

2.1小酒曲浸提液GC-MS分析（圖1、圖2）

通過GC-MS分析得出的總離子流色譜圖看出，大曲浸提液中共檢測出了33種成分，小曲浸提液中共檢測出了32種成分。其中大、小曲中主要成分幾乎相同，有醇類、醛類、酯類及有機酸類。大、小曲浸提液中相對含量較多的是有機酸類。大曲浸提液中含量較高的是棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，其相對含量分別為

圖1小曲浸提液GC-MS總離子流色譜圖

圖2大曲浸提液GC-MS總離子流色譜圖

圖3標(biāo)品對照品混標(biāo)色譜圖

飽和脂肪酸甲酯化后的含量奠定了基礎(chǔ)。16.867%、1.418%、2.098%、20.456%、41.505%，小曲浸提液中含量較高的是丙三醇、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，其相對含量分別為26.231%、17.036%、1.000%、3.558%、29.384%、13.123%。其中不飽和脂肪酸總類中大、小曲浸提液均含有棕櫚油酸、油酸、亞油酸，大曲浸提液含亞油酸相對豐富，小曲浸提液含油酸相對豐富。所以說明董酒在釀造的過程中，大、小曲都對董酒中的微量成分——不飽和脂肪酸有一定的貢獻。

表1各標(biāo)品對照品的回收率及RSD

2.2標(biāo)品對照品的定性分析

從圖3的標(biāo)品對照品混標(biāo)色譜圖來看，5個標(biāo)品峰均能在10min左右出峰完全，而且各標(biāo)品峰形分離度好，相離較近的棕櫚油酸甲酯和油酸甲酯均能滿足定性定量要求。

2.3標(biāo)品對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、重復(fù)性及回收率實驗

結(jié)合圖4和表1來看，各標(biāo)品對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2均在0.998以上，說明各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸性較好?；厥章试?9%～98%之間，實驗準(zhǔn)確度比較可靠。從各標(biāo)品對照品的RSD數(shù)據(jù)來看，各不飽和脂肪酸甲酯的重復(fù)性相對偏低，但是均可滿足用來定性定量測定發(fā)酵液中其含量的重復(fù)性實驗。其中α-亞麻酸甲酯在低濃度范圍時，重復(fù)性相對較差。根據(jù)各標(biāo)品對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸性、回收率及RSD等建立了測定其含量的實驗分析方法。因此為后期測定發(fā)酵液中的5種不

2.4酵母菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)不飽和脂肪酸氣相分析

從圖5可以看出，酵母菌株DJ-5、XJ-4分別是從董酒大、小酒曲中以發(fā)酵性能綜合指標(biāo)篩選出來的酵母菌株，通過鑒定均屬于異常威克漢姆酵母。純種液態(tài)發(fā)酵實驗中，發(fā)酵期為10d，每天取發(fā)酵液甲酯化后進行GC測定。通過測定得出，在發(fā)酵期為6d或7d時，5種不飽和脂肪酸的含量達到在整個發(fā)酵期的最大值。而無論是大曲浸提液組還是小曲浸提液組，實驗組中不飽和脂肪酸含量均比對應(yīng)的空白組高。各不飽和脂肪酸含量最大值：肉豆蔻油酸2.8614 mg/L±0.86 mg/L、棕櫚油酸2.9790 mg/L±0.51 mg/L、油酸2.9073 mg/L±0.28mg/L、亞油酸9.5731 mg/L±0.47 mg/L、α-亞麻酸0.6488 mg/L± 0.63mg/L。由圖5可看出，2株酵母菌相對應(yīng)的各個不飽和脂肪酸的含量差異不大，但是，2組實驗組添加的浸提液不同，小曲浸提液對菌株發(fā)酵期間產(chǎn)不飽和脂肪酸比大曲浸提液組的貢獻作用突出。

3　結(jié)論

通過對董酒的大、小酒曲為原料進行浸提，在簡單地定性了其浸提液的大致成分物質(zhì)，從而通過分別添加2種浸提液到發(fā)酵液中，與不添加的形成對照。通過分析發(fā)酵過程中浸提液對酵母菌株在發(fā)酵過程產(chǎn)生不飽和脂肪酸含量的跟蹤測定，結(jié)果表明，添加了浸提液的實驗組確實比空白組產(chǎn)生的上述5種不飽和脂肪酸的含量多，2種浸提液中，小曲浸提液的貢獻作用大于大曲浸提液?？赡苁怯捎谛∏刑砑拥闹兴幊煞指?，這進一步說明董酒的酒曲不僅在釀造發(fā)酵過程中具有作用，而且可能還會帶來一些健康的成分融入董酒中。

圖4各標(biāo)品對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5酵母菌純種液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)不飽和脂肪酸含量圖

參考文獻：

［1］賈翹彥.確立董酒為“董型”白酒的研究報告［J］.釀酒科技，1999（5）：87-91.

［2］劉平忠.董酒的綜合保健功能［J］.中國釀造，1996（3）：10-11.

［3］王傳榮.白酒的香型及其風(fēng)味特征研究［J］.釀酒科技，2008（9）：49-52.

［4］吳天祥，田志強.品鑒貴州白酒［M］.北京：北京理工大學(xué)出版社，2012，

［5］劉昕，吳天祥，趙群麗.董酒大曲和小曲中酵母菌的篩選及發(fā)酵性能研究［J］.釀酒科技，2015（9）：37-39.

［6］李其書，潘德湖，胡高波，等.董酒在新型白酒中的調(diào)味作用［J］.釀酒科技，2006（8）：68-70.

［7］楊濤，李國友，吳林蔚，等.中國白酒健康因子的研究及其產(chǎn)生菌選育和在生產(chǎn)中的應(yīng)用（I）中國白酒健康因子的研究［J］.釀酒科技，2010（12）：65-69.

［8］催利.中國白酒的營養(yǎng)成分及對人體健康的作用［J］.釀酒，2008，35（1）：15-18.

［9］孟寶，郭五林，張海英，等.關(guān)于中國白酒健康問題研究的幾點思考［J］.釀酒，2012，39（5）：12-15.

［10］徐巖，范文來，葛向陽，等.科學(xué)認識中國白酒中的生物活性成分［J］.釀酒科技，2013（9）：1-6

［11］徐占成，唐清蘭.淺談中國名酒劍南春中多不飽和脂肪酸的健康功能［J］.四川食品與發(fā)酵，2007（2）：7-8.

［12］胡國棟，程勁松，朱葉.白酒中游離有機酸的定量測定［J］.色譜，1994，12（4）：265-267.

［13］胡國棟，程勁松，朱葉.氣相色譜法直接測定白酒中的游離有機酸［J］.釀酒科技，1994（2）：11-15.

Effects of Dongjiu Daqu Extract & Dongjiu Xiaoqu Extract on Unsaturated Fatty Acids Content in Fermentation Process

TANG Qingli，LIU Xin and WU Tianxiang
（School of Liquor-making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract:More than 90 kinds of traditional Chinese medicinal materials were added in Dongjiu Xiaoqu and more than 40 kinds of traditional Chinese medicinal materials added in Dongjiu Daqu for the preparation of Daqu extract and Xiaoqu extract respectively.Moreover，the extract was used as the adding liquid during liquid fermentation process（experimental group）.And liquid fermentation without the addition of Xiaoqu extract was the contrast group.After 10d fermentation at 30℃，the fermenting liquid in experimental group/ in contrast group underwent methyl esterification treatment.Then the content of five kinds of unsaturated fatty acids including nutmeg oleic acid，palmitic acid，oleic acid，linoleic acid and alpha linolenic acid was measured by GC.The analytic results suggested that，compared with the contrast group，the content of five kinds of unsaturated fatty acids in the experimental group increased evidently，which proved that Daqu/Xiaoqu made certain contributions to the formation of unsaturated fatty acids in the fermentation process.

Key words:Dongjiu；Daqu extract；liquor-making microbes；liquid fermentation；unsaturated fatty acids；Baijiu

中圖分類號：TS262.3；TS261.4

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0049-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016134

基金項目：“貴州董香型白酒酒體風(fēng)格的研究”產(chǎn)學(xué)研合作項目（項目編號：DJ-H2014140506）。

收稿日期：2016-04-18

作者簡介：湯慶莉（1967-），女，副教授，研究方向：發(fā)酵工程。

通訊作者：吳天祥（1965-），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為發(fā)酵工程，E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn。