基于保護劑篩選及優化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩定性

葉雙雙，周麗，周哲敏

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

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基于保護劑篩選及優化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩定性

葉雙雙，周麗，周哲敏*

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

摘要苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase，PAH)具有治療苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)的潛在藥用價值，而熱穩定性和儲存穩定性差是限制其應用的重要因素。文中考察了多種保護劑對PAH熱穩定性的影響，表明添加10%的甘油可將PAH在50 ℃處理10 min的酶活保留率提高3.1倍，達到 (98.3±0.8)%，同時海藻糖、棉籽糖和甘露醇均能將PAH酶活保留率提高到78%以上。鑒于甘油在臨床應用過程中可能出現不良反應，對后3種保護劑進行正交實驗，獲得最佳復合保護劑組合：2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L 棉籽糖和1.5 mmol/L 海藻糖，可將50 ℃酶活保留率提高3.1倍，達到 (99.3±1.2)%。10%甘油和復合保護劑均能顯著提高PAH在4、20、37 ℃的儲存穩定性，其中添加10%甘油或復合保護劑使得PAH在37 ℃下儲存半衰期分別延長到129.9 h和237.5 h，比未添加保護劑的分別提高了1.9倍和4.3倍。該結果為PAH在醫藥領域的應用奠定了基礎。

關鍵詞苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase，PAH)；保護劑；穩定性

苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase, PAH, EC 1.14.16.1)主要功能是催化苯丙氨酸羥化反應生成酪氨酸。人體內PAH基因突變導致該酶的活性降低或喪失，苯丙氨酸代謝紊亂，最終形成苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)[1-2]。目前該疾病患者只能通過攝入低苯丙氨酸或不含苯丙氨酸的配方食品或低蛋白食物[3]來控制疾病。但是這種治療方法會導致患者微量元素缺乏、脂肪酸缺乏和低膽固醇血癥等[4]。如果能將PAH直接添加到食物中，可有效控制苯丙氨酸同時不影響其他營養物質攝入。紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)PAH的催化區域與人類來源PAH幾乎完全一致，能夠在人體溫度和pH條件下催化苯丙氨酸羥化反應，且相對其他來源的PAH穩定性更高[5]。YEW等[6]運用紫色色桿菌PAH成功降低了正常小鼠血液中苯丙氨酸水平，為其在功能食品領域的運用提供了參考。然而，穩定性低仍然是限制PAH進一步應用的重要因素[7]。

酶的熱穩定性和儲存穩定性是影響其在醫藥、食品等領域應用的關鍵因素。在諸多提高酶蛋白穩定性的方法中，添加保護劑不僅能有效提高酶的熱穩定性，延長酶類的保存時間，而且工藝簡單，成本低。如GEORGE等[8]在木聚糖酶中分別添加甘油、山梨醇、甘露醇、明膠或海藻糖等，均顯著提高了木聚糖酶在80 ℃條件下的穩定性；李群等[9]發現，添加0.5 mmol/L海藻糖的乙醇脫氫酶在30～60 ℃條件下處理20 min后酶活保留率顯著升高。此外，一些研究者發現將多種保護劑組合，可進一步提高酶的熱穩定性和儲存穩定性。例如，劉彩琴等[10]在α-半乳糖苷酶中添加復合保護劑(1.75 mmol/L海藻糖、1.5 mmol/L甘露醇和2 mmol/L棉籽糖)，使α-半乳糖苷酶在30～60 ℃時酶活保留率提高11.6%～21.7%；COASTA[11]等人在過氧化氫酶中加入由甘油和聚乙烯乙二醇組成的復合保護劑提高了其儲存穩定性。

常用的酶保護劑有多元醇、糖類、氨基酸、鹽類、蛋白質、大分子聚合物等[12-17]，這些保護劑對酶的作用機制是使酶表面完全水化和保護劑完全結合之間建立其一種平衡，從而改變溶液的熱力學性質，發揮保護蛋白質穩定性的作用[18-20]。本研究選取多種適用于醫藥領域的保護劑，考察它們對PAH熱穩定性的影響，通過正交實驗確定最佳保護劑組合，并比較了最佳保護劑在不同溫度下的儲存效果。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

菌種：EscherichiacoliBL21(DE3)/pET24a-pah由本實驗室構建并保存[7]。

保護劑：海藻糖、乳糖、蜜二糖、棉籽糖、甘油、山梨醇、甘露醇、CaCl2、山梨酸鉀、NaCl、白蛋白、L-半胱氨酸、明膠。

發酵培養基：2YT培養基(胰蛋白胨15 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 10 g/L)。

1.1.2主要儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺，美國Thermo公司；超聲破碎儀，美國SONICS公司；CF16RXⅡ離心機，日本HITACHI公司；HYG-A全溫立式搖床，江蘇太倉設備廠；AKTAXPRESS蛋白純化儀，通用電氣醫療機械集團；HiTrap FF DEAE 1mL陰離子柱，通用電氣醫療器械集團。

1.2實驗方法

1.2.1PAH的制備

以E.coliBL21(DE3)/pET24a-pah作為出發菌株，當菌種OD600值=0.6時，添加終濃度0.6 mmol/L 的IPTG，24 ℃ 200 r/min條件下發酵24 h。菌種發酵培養后離心(8 000 r/min，4 ℃，5 min)收集細胞。用適當體積20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl重懸后用超聲破碎儀破碎，離心(12 000 r/min，4 ℃，30 min)取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，經DEAE陰離子交換柱純化目的蛋白[7]，獲得較純的目的蛋白。

1.2.2PAH酶活測定方法

PAH酶液稀釋至0.5 mg/mL，取50 μL加到250 μL 100 mmol/L HEPES(pH 7.5)緩沖液中，然后在該體系中加入50 μL濃度為10 mmol/L的苯丙氨酸、50 μL濃度為50 mmol/L的DTT、50 μL濃度為50 μmol/L FeSO4、50 μL濃度為2 mmol/L的DMPH4，37 ℃處理10 min，加入500 μL甲醇終止反應。15 000 r/min離心30 min，取上清，用0.22 μm微孔有機濾膜過濾，利用HPLC檢測產物生成量[7]。

1.2.3保護劑的篩選

將所選的各種類型的保護劑以一定的比例與PAH混合，50 ℃處理10 min后立即用冰水冷卻，測定殘存酶活。以處理前PAH活性作為100%，分別計算不同條件下的酶活力保留率。

(1)

1.2.4復合保護劑組分優化

根據單因素實驗結果，確定保護劑種類和濃度，進行三因素四水平(采用L16(43)的正交表，如表1)的正交實驗，優化保護劑配方。

1.2.5保護劑對PAH儲存穩定性的影響

儲存實驗分別在4、20、37 ℃(分別屬于保鮮溫度、常溫及PAH最適反應溫度)進行。在酶液中分別添加不同的保護劑，對照組不添加任何保護劑，每隔12 h或24 h取樣測定酶活保留率。

表1　復合保護劑正交實驗因素水平

2結果與分析

2.1保護劑種類對PAH熱穩定性的影響

選取可應用于醫藥領域的保護劑加入到PAH中，50 ℃保溫10 min后測定殘留PAH活性，比較各保護劑對PAH熱穩定性的影響，結果如表2所示。

表2　單一保護劑對PAH熱穩定性的影響

由表2可知，中性鹽對PAH的保護效果較差，其中NaCl對PAH無顯著保護效果，CaCl2、山梨酸鉀對酶活有明顯的抑制作用；而糖類、多元醇、蛋白類、聚合物和氨基酸對PAH的熱穩定性都有一定的促進作用，其中甘油效果最好，添加10%或者20%的甘油后，PAH酶活保留率分別高達 (98.3±0.8)%、(98.9±0.6)%，相比未添加保護劑的對照組(酶活保留率為 (24.3±2.6)%)提高了3.1倍左右，棉籽糖，海藻糖，甘露醇保護效果略次于甘油，處理之后的酶活保留率均高于78%。

已有研究[13]認為，鹽中金屬離子能夠結合酶的帶電基團，從而提高酶的穩定性。本實驗結果表明，鹽類對PAH沒有顯著的效果，CaCl2、山梨酸鉀甚至對PAH活性產生顯著抑制，可能是因為PAH活性中心結合一個Fe2+才能發揮催化作用，當加入其他金屬離子時會干擾Fe2+與酶的活性中心結合，導致酶活下降。

酶的熱穩定性，主要取決于酶分子的空間結構。通常情況下，高溫會導致維系酶分子空間結構的氫鍵或疏水鍵遭到破壞，失去原有的空間構象，最終失去原有的生物活性。當添加甘油、海藻糖、棉籽糖或甘露醇至酶液中，它們的羥基能夠與酶分子表面的酰胺基之間形成氫鍵[21]，因此能有效提高酶的熱穩定性。

2.2保護劑濃度對PAH熱穩定性的影響

在不同濃度保護劑下，50 ℃保溫10 min，PAH活性殘留率如圖1所示。表明棉籽糖的最佳質量體積百分濃度為1.0%，相對酶活為 (94.0±1.8)%，高于同濃度下的海藻糖、甘露醇和甘油。甘油在高濃度(體積分數≥10%)下對PAH具有良好的穩定作用，相對酶活為98%左右，直到甘油濃度提高至50%仍未出現抑制現象。

圖1　保護劑濃度對PAH熱穩定性的影響Fig.1　Effects on thermostability of PAH in the presence of protective additive with different concentrations

2.3復合保護劑對PAH熱穩定性的影響

根據上述單因素實驗結果，10%甘油即表現出非常顯著的保護效果，但是甘油在臨床應用中也會出現一些不良反應，如曾出現由于10%復方甘油引起血紅蛋白尿的病例[22]；口服甘油合劑導致患者出現惡心、嘔吐等癥狀[23]；甘油灌腸劑也可能對患者產生不良反應[24]等。而將多種保護效果略差的保護劑進行合理組合，同樣可達到顯著提高酶穩定性的效果。因此選取甘露醇(A)、棉籽糖(B)、海藻糖(C)三種保護劑設計三因素四水平實驗，優化獲得最佳保護劑組合。結果如表3所示。

由表3極差分析可以看出甘露醇對PAH熱穩定性作用最顯著，海藻糖、棉籽糖效果相似。根據K值得出PAH最佳保護劑配方為A1B1C2，即2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L棉籽糖、1.5 mmol/L海藻糖。

將上述獲得的最佳復合保護劑添加到PAH中，在50 ℃條件下處理10 min，測定殘余酶活，表明酶活保留率達到 (99.3±1.2)%，比未添加保護劑的酶活保留率((24.3±2.6)%)提高了3.1倍。

表3　復合保護劑的正交實驗設計及實驗結果

2.4甘油與復合保護劑對PAH儲存穩定性的影響

酶的穩定性及儲存穩定性是酶臨床應用的重要因素，液體酶直接儲存，容易喪失酶活性，不易長期保存。冷凍真空干燥工藝復雜，成本高，難以大規模應用。因此選擇適合的保護劑提高酶的熱穩定性對該酶的應用具有重要意義。根據單因素和優化復合保護劑結果可以看出，10%甘油和復合保護劑(甘露醇2.5 mmol/L、棉籽糖1 mmol/L、海藻糖1.5 mmol/L)對PAH熱穩定性均具有很好的保護效果。為了比較二者在儲存過程中對PAH的保護效果，分別在4、20、37 ℃三個溫度條件下保溫不同時間，并測定PAH的酶活殘留率。

由圖2 所示，隨著溫度升高PAH失活速度明顯增加，在4 ℃條件下放置兩2后剩余酶活為 (53.6±1.3)%，在20、37 ℃僅放置10天后酶活已分別降至 (19.3±2.5)%、(6.9±1.9)%。添加保護劑能顯著降低PAH失活速度，在4 ℃放置2周，添加保護劑的PAH酶活保留率可達85%左右，比未添加保護劑的對照組高出近58.6%；在20 ℃條件下，添加保護劑處理10天后酶活保留率仍然在50%以上，而不添加保護劑時PAH半衰期僅為84.1 h左右；在37 ℃條件下，添加甘油和復合保護劑后PAH半衰期分別提高到129.9、237.6 h左右，相比未添加保護劑的PAH半衰期(45.2 h左右)分別提高了2.8、4.0倍。

同時，復合保護劑對提高PAH儲存穩定性的效果明顯優于甘油，20 ℃放置10天后添加復合保護劑酶活保留率比添加10%甘油的高出24.1%，在37 ℃放置時添加復合保護劑PAH半衰期(237.6 h左右)較添加甘油(半衰期129.9 h)高出82.9%。表明在不同的儲存溫度下，復合保護劑均比10%甘油更具優勢。

A：4 ℃條件；B： 20 ℃條件；C：37 ℃條件圖2　甘油和復合保護劑對苯丙氨酸羥化酶儲存穩定性的影響Fig.2　Effects on storage stability of PAH in the presence of glycerol or combination additives

3結論

本研究分析了在PAH中添加糖類、多元醇、鹽類、蛋白質、大分子聚合物、氨基酸等化學物質對酶熱穩定性的影響，篩選出了可有效提高PAH穩定性的4種保護劑，分別是甘油、甘露醇、棉籽糖、海藻糖。對甘露醇、棉籽糖、海藻糖進行正交優化得到最佳復合保護劑配方：2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L棉籽糖、1.5 mmol/L海藻糖，可將PAH在50 ℃酶活保留率提高到 (99.3±1.2)%。在4、20、37 ℃下，添加10%甘油或復合保護劑均能提高PAH儲存穩定性，延長儲存時間。與10%甘油相比，溫度越高時復合保護劑對PAH儲存穩定性的保護效果越好。

參考文獻

[1]FLYDAL M I, MARTINEZ A. Phenylalanine hydroxylase: Function, structure and regulation[J]. Annual Review of Nutrition, 2013, 65(4): 341-349.

[2]KALHAN S C, BIER D M. Protein and amino acid metabolism in the human newborn[J]. Annual Review of Nutrition, 2008, 28: 389-410.

[3]WILLIAMS R A, MAMOTTE C D, BURNETT J R. Phenylketonuria: an inborn error of phenylalanine metabolism[J]. The Clinical Biochemist Review, 2008, 29(1): 31-41.

[4]趙彩虹, 張立琴. 苯丙酮尿癥飲食治療及相關營養問題研究進展[J]. 中國兒童保健雜志, 2010, 18(8): 672-674.

[5]LOAIZA A, AMSTRONG K M, BAKER B M, et al. Kinetics of thermal unfolding of phenylalanine hydroxylase variants containing different metal cofactors (Fe Ⅱ, Co Ⅱ, Zn Ⅱ) and their isokinetic relationship[J]. Inorganic Chemisry, 2008, 47(11): 4 883-5 877.

[6]YEW N S, DUFOUR E, PRZYBYLSKA M, et al. Erythrocytes encapsulated with phenylalanine hydroxylase exhibit improved pharmacokinetics and lowered plasma phenylalanine levels in normal mice[J]. Molecular Genetics and Metabolism, 2013, 109(4): 339-344.

[7]曹淑慧, 周麗, 崔文璟, 等. 紫色色桿菌苯丙氨酸羥化酶的異源表達及重組酶學性質研究[J]. 生物技術通報, 2014(8): 153-158.

[8]GEORGE S P, AHMAD A, RAO M B. A novel thermostable xylanase fromThermomonosporasp.: influence of additives on thermostability[J]. Bioresource Technology, 2001, 78(3): 221-224.

[9]李群, 袁勤生, 李永豐. 海藻糖對酶熱穩定性保護作用的研究[J]. 藥物生物技術, 1997(4): 28-31.

[10]劉彩琴, 阮暉, 傅明亮, 等. 提高 α- 半乳糖苷酶穩定性的研究[J]. 食品與發酵工業, 2007, 33(11): 26-29.

[11]COSTA S A, TZANOV T, CARNEIRO A F, et al. Studies of stabilization of native catalase using additives[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 30(3): 387-391.

[12]KIMA J, GRATE J W, WANG P. Nanostructures for enzyme stabilization[J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61(3): 1 017-1 026.

[13]KLIBANOV A M. Stabilization of enzymes against thermal inactivation[J]. Advances in Applied Microbiology, 1983, 29: 1-28.

[14]SCHMID R D. Stabilized soluble enzymes[M]. Advances in Biochemical Engineering. Department of Biotechnology, Henkel KGaA, 1979: 41-118.

[15]OBON J M, MANJON A, IBORRA J L. Comparative thermostability of glucose dehydrogenase fromHaloferaxmediterranei. effects of salts and polyols[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 19(5): 352-360.

[16]COMBES D, MONSAN P. Effect of poloyhydric alcohol on invertase stabilization[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1984, 434: 61-63.

[17]CHEN C C, TU Y Y, CHANG H M. Thermal stability of bovine milk Immunoglobulin G (IgG) and the effect of added thermal protectants on the stability[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(2): 188-193.

[18]TIMASHEFF S N. Control of protein stability and reactions by weakly interacting co solvents: the simplicity of the complicated [J]. Advances in Protein Chemistry, 1998, 51: 355-432.

[19]WANG W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2000, 203(1-2): 1-60.

[20]ARAKAWA T J, PACE A L, LI M, et al. Protein-solvent interactions in pharmaceutical formulations[J]. Pharmaceutical Research, 1991, 8(3): 285-291.

[21]許燕波, 錢春香, 陸兆文. 甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩定性[J]. 東南大學學報(自然科學版), 2013, 43: 147-151.

[22]尹桂玉, 韓貞琳, 李德寬. 10%復方甘油引起血紅蛋白尿3例報告[J]. 哈爾濱醫藥, 1994, 14(4): 50-51.

[23]王桂珍, 施道生. 甘油合劑在眼科臨床的應用及處方改進[J]. 中級醫刊, 1984(4): 38.

[24]徐慰婕, 毛紅梅, 譚月英, 等. 甘油灌腸劑灌腸后不良反應觀察及操作改進后效果對比[J]. 中外健康文摘, 2012, (36): 227-228.

Enhancement of thermostability of phenylalanine hydroxylase based on the strategy of screening and optimization of additives

YE Shuang-shuang, ZHOU Li, ZHOU Zhe-min*

(Schoool of Biotechnology and the Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTPhenylalanine hydroxylase (PAH) is a potential medicine for phenylketonuria (PKU). However, the application of PAH is mainly limited by its low thermostability and storage stability. The effects of several additives on the thermostability of PAH were tested in the present study. Addition of 10% glycerol could improve the residual activity of PAH to (98.3±0.8) % after incubation at 50 ℃ for 10 min, which was 3.1 times higher than that without protective additive. In addition, trehalose, raffinose and mannitol could improve residual activity of PAH to over 78%. In view of the possible adverse reactions of glycerol in the process of clinical application, the later three additives were optimized using the orthogonal experiment. An optimal combination additive of 2.5 mmol/L mannitol, 1 mmol/L raffinose and 1.5 mmol/L trehalose was obtained. With the optimal combination additive, residual activity of PAH could reach (99.3 ± 1.2) %, which was 3.1 times higher than that without protective additive. Both 10% glycerol and the optimal combination additive could significantly improve the storage stability of PAH at 4 ℃, 20 ℃ and 37 ℃. With 10% glycerol or combination additive, the half-life of PAH at 37 ℃ were increased to 129.9 h and 237.5 h, respectively, which were 1.9 times and 4.3 times higher than that without protective additive. The result laid the foundation for medical application of PAH.

Key wordsphenylalanine hydroxylase (PAH ); protective additive; thermostability

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606010

基金項目：國家863計劃(2014AA021304)；2014年基本科研(JUSRP51411B)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(111-2-06)

收稿日期：2015-12-18，改回日期：2016-03-03

第一作者：碩士研究生(周哲敏教授為通訊作者，E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn )。