RNA干擾下調(diào)MBP?1對骨肉瘤Saos?2細胞生物學(xué)的影響

施鑫鶴，耿晢，施星臣，馬克君，朱宏文，任雯，周雅麗

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究所，蘭州 730000；3.蘭州第二人民醫(yī)院骨科，蘭州 730030）

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RNA干擾下調(diào)MBP?1對骨肉瘤Saos?2細胞生物學(xué)的影響

施鑫鶴1，耿晢2，施星臣3，馬克君1，朱宏文1，任雯1，周雅麗1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究所，蘭州 730000；3.蘭州第二人民醫(yī)院骨科，蘭州 730030）

摘要目的探討c?myc啟動子結(jié)合蛋白1（MBP?1）基因沉默對人骨肉瘤Saos?2細胞生長的影響。方法實驗分為3組：正常對照組（未轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染錯義序列組）和沉默組（轉(zhuǎn)染MBP?1shRNA組）。設(shè)計2條MBP?1基因的RNA干擾片段及1條陰性對照siRNA，并與pSIREN?retroQ質(zhì)粒連接。將重組pSIREN?retroQ質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染骨肉瘤Saos?2細胞。實時PCR和Western blot分別檢測MBP?1表達。CCK?8法對MBP?1沉默后骨肉瘤Saos?2細胞生長進行檢測。Western blot檢測對照組和沉默組cyclin D1和cyclin E的表達。結(jié)果通過PCR擴增及測序，說明已成功構(gòu)建MBP?1沉默及對照重組pSIREN?retroQ質(zhì)粒。實時PCR結(jié)果顯示，沉默組MBP?1mRNA相對表達量與對照組相比顯著下調(diào)（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，沉默組MBP?1蛋白表達量與對照組相比也顯著下調(diào)。CCK?8法結(jié)果表明，沉默組細胞在48、72和96 h時增殖能力均比對照組顯著升高（P＜0.05）。沉默組cyclin D1和cyclin E的表達顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論MBP?1基因沉默后骨肉瘤Saos?2細胞生長被明顯促進，為尋找骨肉瘤基因治療新靶點打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞骨肉瘤Saos?2細胞；RNA干擾；c?myc啟動子結(jié)合蛋白1；細胞生長

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骨肉瘤是一種臨床常見惡性骨腫瘤［1］，起源于間葉組織，約占所有骨腫瘤的20%。骨肉瘤好發(fā)于青少年，具有惡性程度高、預(yù)后差等特點。傳統(tǒng)骨肉瘤治療主要是手術(shù)和化療，但其最后療效不佳。隨著分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的興起與發(fā)展，基因治療骨肉瘤越來越受到重視。目前，基因治療特別是癌基因和抑癌基因水平的治療，與傳統(tǒng)的手術(shù)治療和化療相結(jié)合，使得骨肉瘤的治療效果有了顯著提升。在這些腫瘤基因治療研究中，癌基因c?myc是一種被廣泛關(guān)注的能夠促進腫瘤發(fā)生并產(chǎn)生相應(yīng)后續(xù)結(jié)果的基因。c?myc基因表達一種轉(zhuǎn)錄因子，通過改變很多腫瘤細胞生物學(xué)功能，如增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及對凋亡的敏感性等，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［2］。目前的研究也已經(jīng)證明c?myc在很多種人類腫瘤中顯著升高，充分表明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。一種最早在人子宮頸癌HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)的c?myc啟動子結(jié)合蛋白1（c?mycpromoter binding protein 1，MBP?1）被證實是一種能在轉(zhuǎn)錄水平對癌基因c?myc表達進行抑制的蛋白質(zhì)［3］。已知MBP?1結(jié)合到c?myc基因P2啟動子上［4］，通過抑制癌基因c?myc過度表達，特異地抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)效應(yīng)。本研究通過RNA干擾下調(diào)骨肉瘤Saos?2細胞中MBP?1的表達，以了解MBP?1基因下調(diào)對骨肉瘤的影響，為尋找骨肉瘤基因治療新靶點及深入研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

人骨肉瘤Saos?2細胞，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及opti?MEM培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司。RNA干擾質(zhì)粒pSIREN?retroQ（含嘌呤霉素篩選標(biāo)記）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒及感受態(tài)JM109工程菌，購自大連TaKa?Ra公司。引物、質(zhì)粒小量提取試劑盒、去毒素質(zhì)粒提取試劑盒、RIPA裂解液，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。RNA抽提試劑Trizol、脂質(zhì)體LipofectionTM2000，購自美國Invitrogen公司。MBP?1兔抗人多克隆抗體，購自美國Abcam公司。兔抗人多克隆cyclin D1，購自美國Abcam公司。兔抗人cyclin E，購自美國Santa Cruz公司。人β?actin、山羊抗兔辣根過氧化物酶、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。CCK?8試劑盒，購自日本同仁株式會社化學(xué)研究所。

1.2實驗方法

1.2.1RNA沉默質(zhì)粒設(shè)計：針對MBP?1沉默序列及陰性對照序列委托大連TaKaRa公司設(shè)計合成，干擾靶序列1（CTE954?1）為GCAACTCTGAAGTCATCC TGC；正義鏈，GATCCGCAACTCTGAAGTCATCCTG CTTCAAGAGAGCAGGATGACTTCAGAGTTGCTTT TTTG；反義鏈，AATTCAAAAAAGCAACTCTGAAGT CATCCTGCTCTCTTGAAGCAGGATGACTTCAGAGT TGCG。干擾靶序列2（CTE954?3）為GCATTGGAGC AGAGGTTTACC；正義鏈，GATCCGGACTACCCAGT GGTGTCTATTTCAAGAGAATAGACACCACTGGGT AGTCCTTTTTTG；反義鏈，AATTCAAAAAAGGACT ACCCAGTGGTGTCTATTCTCTTGAAATAGACACCA CTGGGTAGTCCG。同時設(shè)計陰性序列對照質(zhì)粒（CTE954?N），靶序列為GTACCTCTAGCGATCAAACG A；正義鏈，GATCCGTACCTCTAGCGATCAAACGAT TCAAGAGATCGTTTGATCGCTAGAGGTACTTTTTT G；反義鏈，AATTCAAAAAAGTACCTCTAGCGATCA AACGATCTCTTGAATCGTTTGATCGCTAGAGGTAC G。引物退火后將退火產(chǎn)物分別與pSIREN?retroQ （BamHⅠ/EcoRⅠ）載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109工程菌。用引物pSIREN正義鏈和pSIREN反義鏈對陽性克隆進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。引物序列為pSIREN正義鏈，TGGATGTGG AATGTGTGCGA；pSIREN反義鏈，TTTGTACACCC TAAGCCTCC。此外為保證干擾質(zhì)粒準(zhǔn)確設(shè)計與構(gòu)建，用U6正義鏈、pSIREN正義鏈引物對陰性對照和沉默質(zhì)粒進行測序。U6正義鏈測序引物序列為CTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTC。RNA沉默序列設(shè)計及后續(xù)相應(yīng)干擾載體選擇、陽性克隆電泳及質(zhì)粒測序均由大連TaKaRa公司提供并完成。

1.2.2人骨肉瘤細胞培養(yǎng)：人骨肉瘤Saos?2細胞系于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中，5% CO2、37℃環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3RNA沉默及對照骨肉瘤Saos?2細胞獲取：實驗細胞分為3組：（1）正常對照組，即骨肉瘤Saos?2細胞；（2）陰性對照，質(zhì)粒為pSIREN?retroQ陰性對照CTE954?N；（3）沉默組，質(zhì)粒分別為pSIREN?retroQ干擾質(zhì)粒CTE954?1和CTE954?3。將陰性對照質(zhì)粒及2條沉默質(zhì)粒通過LipofectionTM2000分別轉(zhuǎn)染人骨肉瘤Saos?2細胞，具體方法參見脂質(zhì)體Lipofec?tionTM2000轉(zhuǎn)染說明書，獲得正常對照組、陰性對照組和2個沉默組骨肉瘤Saos?2細胞。

1.2.4實時定量PCR檢測MBP?1表達：取正常對照組、陰性對照組和2個沉默組骨肉瘤Saos?2細胞，RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，具體方法參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。取cDNA產(chǎn)物，實時PCR擴增檢測MBP?1基因表達，具體方法參照大連TaKaRa公司實時定量PCR操作說明書。MBP?1引物序列，F(xiàn)，CGTTCAATGTCATCAAT GGCGGT；R，CTTCAGGTTGTGGTAAACCTCTG。實時定量PCR內(nèi)參人GADPH序列，F(xiàn)，AACAGCCTCA AGATCATCAGCAA；R，GAGTCCTTCCACGATACC AAAGT。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5Western blot檢測MBP?1蛋白表達：取正常對照組、陰性對照組和2個沉默組骨肉瘤 Saos?2細胞，SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗1∶500稀釋于5%脫脂奶粉，4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶500稀釋于5%脫脂奶粉與硝酸纖維素膜搖床平臺上溫育1 h；ECL發(fā)光，暗盒曝光，取出X線片顯影、定影。一抗為兔抗人MBP?1多克隆抗體，二抗為山羊抗兔辣根過氧化物酶。

1.2.6CCK?8法檢測細胞生長：取對數(shù)生長期骨肉瘤Saos?2細胞，按5 000/孔的細胞密度接種于96孔板，每孔含無血清培養(yǎng)液100 μL，實驗分組同前，細胞培養(yǎng)24 h后，分別根據(jù)前述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染各組細胞并繼續(xù)培養(yǎng)，每組分別在24、48、72、96 h檢測細胞活性，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入CCK?8試劑10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)3 h，在酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測吸光度值。根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測cyclin D1和cyclin E：取空白對照組、陰性對照組、2個沉默組骨肉瘤細胞，Western blot檢測cyclin D1和cyclin E的表達。一抗為兔抗人cyclin D1多克隆抗體和兔抗人cyclin E抗體，二抗為山羊抗兔辣根過氧化物酶。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1RNA沉默載體鑒定

用pSIREN正義與反義引物對質(zhì)粒進行PCR擴增、電泳（圖1），說明MBP?1pSIREN?retroQ RNA沉默質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒都已經(jīng)準(zhǔn)確設(shè)計與構(gòu)建。進一步通過U6正義鏈、pSIREN正義鏈引物對陰性對照組和2個沉默組質(zhì)粒進行測序（圖2），進一步印證MBP?1沉默質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒都已經(jīng)準(zhǔn)確建立。

2.2實時PCR檢測MBP?1沉默效率

圖1　PCR擴增陰性對照質(zhì)粒和沉默組質(zhì)粒Fig.1PCR amplification of pSIREN?retroQCTE954-N，CTE954-1andCTE954-3

實時PCR檢測MBP?1mRNA表達，2個沉默組（CTE954?1和CTE954?3）細胞MBP?1mRNA表達顯著低于陰性對照組（CTE954?N）。沉默組CTE954?1表達為0.49±0.035，CTE954?3表達為0.45±0.030，說明我們構(gòu)建的MBP?1干擾序列能有效下調(diào)骨肉瘤Saos?2細胞中MBP?1基因在mRNA水平的表達。2.3Western blot檢測MBP?1沉默效率

為進一步了解設(shè)計、建立的MBP?1沉默序列能否有效下調(diào)骨肉瘤Saos?2細胞中MBP?1在蛋白水平的表達，取對照組和沉默組細胞，Western blot檢測MBP?1表達（圖3），2個沉默組細胞MBP?1蛋白表達水平明顯低于陰性對照組，進一步印證了沉默組與對照組序列設(shè)計的準(zhǔn)確。

2.4CCK?8法檢測沉默組骨肉瘤Saos?2細胞生長

為了解MBP?1基因沉默是否對骨肉瘤Saos?2細胞生長產(chǎn)生影響，通過CCK?8實驗（圖4）檢測對照組和2個沉默組骨肉瘤Saos?2細胞增殖。通過測定24、48、72和96 h沉默組和對照組450 nm吸光度值，發(fā)現(xiàn)2個沉默組細胞在48、72、96 h吸光度值都顯著高于陰性對照組，說明MBP?1基因沉默后骨肉瘤Saos?2細胞生長即增殖被顯著促進。

圖2　陰性對照和沉默組測序圖Fig.2DNA sequencing of pSIREN?retroQCTE954-N，CTE954-1andCTE954-3

圖3　Western blot檢測MBP-1沉默細胞MBP?1表達Fig.3　Expression of MBP?1 inMBP-1siRNA Saos?2 cell line by Western blot

圖4　CCK?8法檢測MBP-1沉默細胞生長Fig.4　Cell proliferation ofMBP-1siRNA Saos?2 cell line by CCK?8 assay

2.5Western blot檢測沉默組骨肉瘤細胞cyclin D1 和cyclin E表達

為進一步了解MBP?1基因沉默對Saos?2細胞增殖影響的深層機制，采用Western blot檢測正常對照組、陰性對照組和2個沉默組細胞中cyclin D1和cy?clin E表達（圖5），結(jié)果表明cyclin D1和cyclin E在2個沉默組中的表達水平均明顯高于陰性對照組。說明MBP?1基因下調(diào)后影響了骨肉瘤Saos?2細胞中與細胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)的cyclin D1和cyclin E的表達，cyclinD1和cyclinE的表達在沉默組均顯著增高。

3　討論

癌基因c?myc編碼一種細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在人類許多腫瘤中都被發(fā)現(xiàn)有過量表達［5］。在促有絲分裂的刺激下，c?myc被快速誘導(dǎo)生成并調(diào)節(jié)正常的細胞周期［6］，而過度表達c?myc會導(dǎo)致細胞中心體數(shù)目異常［7］。研究［8］還證實c?myc通過誘導(dǎo)DNA損傷和細胞中心體失常，使染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性損壞。最近的研究［9］證明，c?myc在轉(zhuǎn)錄水平增強幾乎所有被激活基因表達，而不僅僅是對傳統(tǒng)認識上的特異靶基因。

圖5　Western blot檢測MBP-1沉默細胞cyclin D1和cyclin E的表達Fig.5　Expressions of cyclin D1 and cyclin E inMBP-1siRNA Saos?2 cell line by Western blot

由于在很多人類腫瘤中都發(fā)現(xiàn)癌基因c?myc異常過量表達，如胃癌、肝癌還有骨肉瘤，而目前的研究發(fā)現(xiàn)許多有關(guān)異常腫瘤細胞生物學(xué)特性的表現(xiàn)如惡性增殖、侵襲性、轉(zhuǎn)移等都與c?myc過度表達直接相關(guān)。c?myc在許多腫瘤中存在異常表達，其激活的主要方式是擴增和過表達，通過與其下游靶基因結(jié)合，影響細胞增殖、生長代謝、基因的不穩(wěn)定性、刺激血管生成、細胞惡性轉(zhuǎn)化、分化及凋亡等。而MBP?1恰好在轉(zhuǎn)錄水平抑制c?myc表達，因此腫瘤的過度增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性就會相應(yīng)地被抑制。由于MBP?1通過抑制c?myc過度表達而具有特殊功能，通過其自身表達可以對某些癌基因表達進行抑制，從而在許多腫瘤生物學(xué)環(huán)節(jié)中發(fā)揮其特殊的類似抑癌基因的作用［10］。尋找上述對某些癌基因具有控制作用的基因也是目前腫瘤基因治療靶點尋找的熱點，因此以MBP?1為靶點基因治療在腫瘤治療上具有廣闊的前景和應(yīng)用價值。目前MBP?1腫瘤生物學(xué)功能研究也證實，作為一種通過抑制癌基因c?myc過度表達從而控制腫瘤細胞特異生物學(xué)效應(yīng)的基因，其表達對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移［11］和凋亡［12］等都有相應(yīng)作用。而新近在胃癌細胞研究中的例子更是發(fā)現(xiàn)c?myc和Cox2均在胃癌細胞中過量表達，目前發(fā)現(xiàn)它們過表達是由于一種小干擾miRNA?363的表達升高引起的［13］，而這種效應(yīng)的發(fā)生是通過抑制MBP?1表達來實現(xiàn)；相反，過表達MBP?1則使胃癌細胞中c?myc和Cox2表達顯著下調(diào)。

正是基于以上認識，我們通過RNA沉默技術(shù)下調(diào)骨肉瘤Saos?2細胞中MBP?1表達，通過PCR擴增及測序證實已經(jīng)成功構(gòu)建pSIREN?retroQ沉默載體和陰性對照載體。實時PCR及Western blot檢測2個沉默組MBP?1表達均明顯低于對照組，說明MBP?1沉默Saos?2細胞已成功獲取。CCK?8法檢測MBP?1表達下調(diào)后骨肉瘤Saos?2細胞生長在48～96 h均比對照組顯著增高，說明作為一種通過抑制癌基因c?myc過度表達從而抑制腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移并促進腫瘤細胞凋亡的蛋白質(zhì)，其自身的基因表達發(fā)揮一種重要的監(jiān)督作用。為進一步了解這種監(jiān)督效應(yīng)的分子生物學(xué)機制，本研究采用Western blot檢測對照組和2個沉默組中cyclin D1和cyclin E的表達，發(fā)現(xiàn)MBP?1基因下調(diào)后Saos?2細胞中cyclin D1和cy?clin E表達都顯著增高。cyclin D1異常表達和人類腫瘤緊密相關(guān)，cyclin D1異常表達會促進腫瘤選擇性生長［14］。因此，在很多人類腫瘤中cyclin D1都是腫瘤生長的驅(qū)動因素［15］。而異常表達cyclin E也與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)［16］。以上結(jié)果說明，作為通過抑制癌基因c?myc過度表達而對腫瘤生物學(xué)作用具有監(jiān)督作用的MBP?1，其基因下調(diào)很可能在某種程度上導(dǎo)致cyclin D1和cyclin E表達異常，而這種表達的異常升高最終影響到Saos?2細胞增殖。

骨肉瘤發(fā)生是多基因、多步驟、多階段、多重損傷并存的過程，我們通過RNA沉默下調(diào)骨肉瘤Saos?2細胞MBP?1的表達，促進了細胞增殖，說明MBP?1基因自身表達在控制骨肉瘤細胞增殖中發(fā)揮重要的監(jiān)督作用。進一步研究MBP?1對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制，將為未來基因治療尋找骨肉瘤新靶點及其深入研究打下基礎(chǔ)。

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（編輯陳姜）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：

中圖分類號R738.3

文獻標(biāo)志碼A

文章編號0258-4646（2016）07-0604-06

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.007

基金項目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃一般項目（1308RJZA152）

作者簡介：施鑫鶴（1973-），男，副主任檢驗師，碩士. E-mail：shixh@lzu.edu.cn

收稿日期：2015-12-07

Effects of RNA Interfering of MBP?1 on Proliferation of Saos?2 Cell Line

SHI Xinhe1，GENG Zhe2，SHI Xingchen3，MA Kejun1，ZHU Hongwen1，REN Wen1，ZHOU Yali1
（1.Central laboratory of Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou University，Lanzhou 730030，China；2.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Lan?zhou Medical College，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.Department of Bone Surgery，The Second People’s Hospital of Lanzhou，Lanzhou 730030，China）

AbstractObjectiveTo investigate the effects of c?myc promoter binding protein 1（MBP?1）gene on the proliferation of human Saos?2 osteo?sarcoma cells in vitro.MethodsSaos?2 cells were divided into three groups：blank control group（untransfected cells），negative group（cells transfected with missense sequence）and experimental group（cells transfected withMBP?1shRNA）.TwoMBP?1shRNA sequences and one neg?ative control shRNA sequence were designed，synthesized and cloned into pSIREN?retroQ plasma.Then the recombinant plasmids were construct?ed and transfected into human Saos?2 osteosarcoma cells by Lipofectamine 2000.The expressions ofMBP?1mRNA and protein in Saos?2 cells were detected by real?time PCR and Western blot，respectively.The effects of altered expression of MBP?1 on cell proliferation were measured by CCK?8 cell proliferation assay.The expressions of cyclin D1 and cyclin E in Saos?2 were determined by Western blot.ResultsPCR and sequenc?ing results indicated that the recombinant plasmids pSIREN?retroQ was constructed.The relative expression level ofMBP?1mRNA in theMBP?1 siRNA transfection group was significantly decreased than that in blank control group（P＜0.05）.Compared with the blank control group，the ex?pression levels of MBP?1 protein in the experimental group also significantly decreased.The proliferation abilities of Saos?2 cells at 48，72，and 96 hours afterMBP?1siRNA transfection were significantly increased than those in the blank control group（P＜0.05）.Compared with the blank con?trol group，the expression levels of cyclin D1 and cyclin E protein in the experimental group also significantly increased（P＜0.05）.Conclusion Knockdown of the expression ofMBP?1gene promotes the proliferation of human Saos?2 osteosarcoma cells.MBP?1gene may become the new tar?get of gene therapy for osteosarcoma.

Keywordsosteosarcoma Saos?2 cells；RNA interfering；c?myc promoter binding protein 1；cell proliferation