黃柏提取物對番茄枯萎病的生物防治效果

馬欣++霍蓉++喬俊卿

摘要：通過測定菌絲干質量、菌絲生長速率、孢子萌發率等，研究黃柏的乙醇提取物對番茄枯萎病菌的室內抑菌作用，利用溫室盆栽試驗評估黃柏提取物對番茄枯萎病的防治效果。試驗結果表明，黃柏提取物對番茄枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發均有顯著抑制作用，且抑制率隨提取物質量濃度的增大而升高，質量濃度為32 000 mg/L時對枯萎病菌菌絲生長的抑制作用達到80%以上，抑制中濃度（MIC）為7 530 mg/L。質量濃度為16 000 mg/L的處理對孢子萌發的抑制率高達100%。在盆栽試驗中，質量濃度為16 000 mg/L的處理對番茄枯萎病的保護防治效果達73.53%，顯著高于常規化學藥劑。試驗表明，黃柏提取物對番茄枯萎病菌具有較好的防治效果。

關鍵詞：黃柏；乙醇提取物；番茄枯萎?。灰志饔?；防治效果

中圖分類號： S436.412.1+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0178-03

番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的番茄生產中一種重要的土傳病害[1]。該病原菌經土壤傳染，從根部侵入，傳染性極強[2]，發病率一般為20%～30%，受害較重的地區發病率高達80%以上，嚴重危害番茄的產量和品質[3]。目前生產中主要采用多菌靈、咪鮮胺、苯醚甲環唑等化學藥劑防治番茄枯萎病[4]，長期大量使用化學農藥將導致番茄枯萎病菌抗藥性風險增加、有毒化學物質殘留量增加、生態環境污染加重，嚴重威脅人類健康和生存。人們對綠色、有機食品的需求越來越大，開發低毒、低殘留、無污染、與環境和諧的新型農藥已迫在眉睫[5]。植物中含有多種天然化學成分，已成為新型生物農藥開發的重要材料資源。筆者曾用近10種中草藥的乙醇提取物對番茄枯萎病菌進行抑菌活性的離體測定，研究結果表明，黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌活性最高[6]。本研究利用黃柏的乙醇提取物對番茄枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發的抑制作用，以及在番茄活體上的保護和治療作用進行測定，以期為新型植物源殺菌劑的開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1黃柏供試中藥黃柏（Phellodendron chinense Schneid.）屬蕓香科，購自山西省運城市中藥市場，使用枝皮部位。

1.1.2供試菌種和培養基番茄枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）分離自發病番茄的根部，由馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基于28 ℃下繼代培養，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2方法

1.2.1黃柏提取液的制備采用超聲波提取法制備黃柏提取液。將陰干的黃柏材料置于45 ℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，采用植物粉粹機將材料粉碎，過80目篩后備用。稱取樣品干粉100 g，用70%乙醇按1 g ∶6 mL的料液比浸泡，充分攪拌使溶劑完全浸沒中草藥材料，置于避光處靜置24 h；于45 ℃、80 Hz條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，再次采用同樣方法處理殘渣，重復提取3次，合并3次濾液。采用旋轉蒸發儀于40 ℃條件下將濾液減壓濃縮至無溶劑蒸出（呈浸膏狀），并用50%乙醇定容至106 mg/L，密封標記后置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2黃柏提取物對番茄枯萎病病原菌菌絲生長的抑制作用采用菌絲干質量法測試黃柏提取物對番茄枯萎病病原菌菌絲生長的抑制作用。用100 mL PD培養液將黃柏提取物分別稀釋至32 000、16 000、8 000 mg/L，在各質量濃度培養液中分別加入3片直徑為0.6 cm的番茄枯萎病病原菌菌餅，于 28 ℃ 下振蕩培養10 d。采用經充分干燥并稱質量的濾紙過濾，于80 ℃下烘干至恒質量。以不添加任何藥劑的PD培養液作為空白對照，稱量菌絲干質量并計算抑菌率，每個處理重復3次[7]。

抑菌率=（對照菌絲干質量-處理菌絲干質量）/對照菌絲干質量×100%。

1.2.3黃柏提取物對番茄枯萎病病原菌菌絲抑制中濃度（MIC）的測定將1 g/mL的黃柏提取液分別稀釋成質量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500 mg/L的帶藥培養基，采用生長速率法進行抑菌活性的離體測定，每個處理重復3次；以混有50%乙醇的PDA培養基、純PDA培養基作為對照。于28 ℃恒溫培養箱中培養后，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算不同質量濃度黃柏提取物對番茄枯萎病病菌菌絲生長的抑制率，并計算抑制率達到50%時黃柏提取物的質量濃度，即抑制中濃度（MIC）[8]。

菌落直徑=測量菌落直徑平均值-0.6 cm；

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.4黃柏提取物對番茄枯萎病病原菌孢子萌發的抑制作用試驗采用稀釋平板計數法[9]測定黃柏提取物對番茄枯萎病病原菌孢子萌發的抑制作用。制備6×106 CFU/mL的番茄枯萎病菌菌懸液，并稀釋至約100 CFU/mL。吸取20 μL菌懸液于含黃柏提取物質量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500 mg/L的帶藥固體培養基平板中，采用涂菌棒涂布均勻并靜置15 min，將培養皿倒置以防止皿蓋冷凝水下滴，于28 ℃恒溫培養箱中培養96 h，每個處理重復3次。培養完成后進行菌落計數，涂布提取物平板菌落數記為C，對照組菌落數記為C0，計算抑制率。

萌發率=孢子萌發數/檢查孢子總數=C/C0×100%；

抑制率=（對照萌發率-處理萌發率）/對照萌發率=（C0-C）/C0×100%。

1.2.5黃柏提取物對番茄枯萎病的保護和治療效果采用盆栽試驗法測定黃柏提取物對番茄枯萎病的保護和治療效果。將番茄種播于滅菌土壤中，當番茄苗長出6片真葉時進行移苗。將秧苗移栽至裝有100 g無菌土的盆缽中，每盆1株。

進行黃柏提取物對番茄枯萎病的保護效果試驗。分別取質量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000 mg/L的黃柏提取物20 mL，灌根處理番茄苗，24 h后灌根接種20 mL番茄枯萎病菌孢子懸浮液（5×106 CFU/mL）。

進行黃柏提取物對番茄枯萎病的治療效果試驗。每株番茄苗灌根接種20 mL番茄枯萎病菌孢子懸浮液（5×106 CFU/mL），24 h后分別取質量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000 mg/L的黃柏提取物20 mL，灌根處理番茄苗。以50%多菌靈處理作為化學藥劑對照，以清水處理作為空白對照。每個處理重復3次，每個重復設3盆番茄，常規管理，于30 d后調查病情，計算病情指數和防治效果。

病害分級標準如下。0級：無癥狀；1級：1或2片葉子明顯變黃以致脫落；2級：3或4片真葉變黃，葉片萎蔫下垂；3級：5或6片真葉變黃，或真葉萎蔫下垂；4級：全株嚴重萎蔫以致枯死[10]。

病情指數=∑（各級病株數×代表級值）/（調查總株數×最高代表級值）×100；

防治效果=（1-試驗區病情指數/對照區病情指數）×100%。

2結果與分析

2.1黃柏提取物對菌絲生長的抑制作用

在含有不同質量濃度黃柏提取物的培養液中生長的番茄枯萎病菌菌絲，其質量受到不同程度的抑制。試驗結果（表1）表明，經黃柏提取物處理的菌絲，其平均干質量在0.05水平與對照存在顯著差異，且黃柏提取物各質量濃度處理間也存在顯著差異。其中，質量濃度為32 000 mg/L的黃柏提取物處理對番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制作用最強，抑制率高達 80.42%；質量濃度為8 000 mg/L的處理對番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制率不到50%。可見，黃柏提取物對番茄枯萎病菌菌絲的抑菌作用與提取物質量濃度呈正相關，抑菌效果隨著質量濃度的降低而減弱。

2.2黃柏提取物對菌絲的抑制中濃度（MIC）

分別以黃柏提取物的質量濃度、對番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制率為坐標軸，得到抑制率變化趨勢曲線，其相關擬合方程為y=0.049 3x+0.128 9。根據此方程計算抑制率達到50%時黃柏提取物的質量濃度，即抑制中濃度（MIC）為 7 530 mg/L（圖1）。

2.3黃柏提取物對孢子萌發的抑制作用

黃柏提取物對番茄枯萎病孢子萌發的抑制作用見表2，不同質量濃度的黃柏提取物對番茄枯萎病孢子的萌發均有一定抑制作用。質量濃度為16 000 mg/L時抑制作用最顯著，抑制率達到100%，完全抑制了番茄枯萎病菌孢子的萌發；質量濃度為1 000 mg/L時抑制作用不顯著，抑制率僅為 14.29%，抑制作用隨著質量濃度的降低而減弱。

2.4黃柏提取物對番茄枯萎病的防效試驗

由表3可知，對照處理中番茄枯萎病的病情指數為 94.44，表明盆栽試驗中對照處理的發病程度較嚴重。在保護作用的測定中，不同質量濃度黃柏提取物的防治效果存在一定差異。黃柏提取物對番茄具有一定保護作用，能夠抑制番茄枯萎病菌的侵染，防治效果隨黃柏提取物質量濃度的增大而提高，16 000 mg/L時防治效果達73.53%，顯著高于常規化學藥劑多菌靈。在治療作用的測定中，不同質量濃度黃柏提取物的防治效果存在一定差異，且防治效果隨質量濃度的增大呈上升趨勢；在相同質量濃度處理下，治療防治效果均低于保護防治效果。可見，質量濃度為16 000 mg/L的黃柏提取物處理表現出較強的保護防治效果。

3結論與討論

生物農藥具有選擇性強、不易使害蟲和病菌產生抗藥性、對環境友好、對人畜安全、不殺傷天敵、易分解的優點，新型生物農藥的研究與開發已成為農藥發展的重要方向，具有巨大發展潛力。近年來，對番茄枯萎病生物防治的研究主要集中于生防菌，已報道的有木霉菌、非致病尖孢鐮刀菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等[1，11]，而關于抑菌植物的應用和研究極少。目前已報道的對番茄枯萎病具有顯著抑制作用的植物主要有月腺大戟、大蒜。月腺大戟根總黃酮純化物對番茄枯萎病菌具有顯著抑制作用，且抑制率隨總黃酮濃度的升高而增加[11]。謝成俊研究表明，大蒜素揮發油2 000倍液對番茄枯萎病菌的防治效果為99.12%，抑制作用顯著[12]。月腺大戟、大蒜的抑菌穩定性及其在番茄生產中的應用有待進一步研究。

中國擁有豐富的藥用植物資源，是開發植物源農藥的理想來源[13]。黃柏是蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥樹皮，具有抗菌、抗滴蟲、治療肝炎、抗潰瘍、抗氧化、抗癌等多種藥理活性，已被廣泛應用于醫藥領域[14]，然而幾乎沒有關于抑制植物病原菌的研究。本研究結果表明，黃柏提取物對番茄枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發均有顯著的抑制作用，且抑制率隨提取物質量濃度的升高而增加，抑制中濃度（MIC）為7 530 mg/L。質量濃度為16 000 mg/L時的抑制作用最顯著，對孢子萌發的抑制率達到100%；在盆栽試驗中表現出較強的保護防治作用，防治效果達73.53%，顯著高于常規化學藥劑。以黃柏為材料開發防治番茄枯萎病的植物源殺菌劑，具有較好的開發潛力和應用前景。本試驗在黃柏提取物對番茄枯萎病菌的防治作用方面取得了一定進展，而黃柏提取物的抑菌有效成分、作用機制、抑菌穩定性等有待進一步研究。

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