當歸補血湯對糖尿病大鼠腎組織NF-κB、MCP-1表達的影響*

王秀萍，任小旦，張瑩雯

（武漢大學附屬中南醫院，武漢　430000）

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·實驗研究·

當歸補血湯對糖尿病大鼠腎組織NF-κB、MCP-1表達的影響*

王秀萍，任小旦，張瑩雯

（武漢大學附屬中南醫院，武漢430000）

摘要：［目的］觀察當歸補血湯干預下糖尿病大鼠腎臟核因子-κB（NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）炎癥因子表達變化，探討當歸補血湯抗炎機制及其與腎臟保護作用的相關性。［方法］鏈脲佐菌素（STZ）+高脂飼料建立糖尿病腎病（DN）動物模型，酶偶聯比色法檢測血糖、血脂及腎功能相關指標，光鏡、電鏡下觀察腎臟結構變化，酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠腎臟NF-κB、MCP-1蛋白含量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測腎臟NF-κBp65、MCP-1 mRNA表達變化。［結果］DN大鼠腎功能下降，腎臟損傷嚴重，腎組織NF-κB、MCP-1蛋白含量增加，NF-κBp65、MCP-1mRNA轉錄活性增強，當歸補血湯治療后腎功能明顯改善，腎臟NF-κB、MCP-1蛋白含量降低，NF-κBp65、MCP-1 mRNA轉錄活性下降。［結論］當歸補血湯可有效減少DN大鼠腎臟NF-κB、MCP-1的表達及活性，抑制腎臟炎癥反應，減輕腎臟損傷。

關鍵詞：當歸補血湯；糖尿病腎病；炎癥；核因子-κB；單核細胞趨化蛋白-1

糖尿病及其并發癥已成為世界公共衛生領域的防治焦點，2010年中國國家疾病控制中心和中華醫學會內分泌學分會調查結果顯示，中國18歲以上人群糖尿病患病率為9.7%，其中20%～40%會發生糖尿病腎病（DN）［1］。隨著對DN的研究不斷深入，各種新的治療手段也相繼提出，但DN患病率仍持續增長，病情控制也遠不如預期，每年大量的DN患者進展為終末期腎病，在生活質量降低的同時也帶來沉重的經濟負擔，因此積極探索有效的防治措施具有重要的現實意義。近年來研究發現炎癥在DN的發生和發展中具有重要意義［2-3］，改善腎臟微炎癥狀態有望成為臨床治療DN的新靶點。當歸補血湯是中醫藥經典方劑，在臨床及實驗研究中發現其可有效改善DN的腎臟損傷，但其對DN時腎臟炎癥的作用尚未見報道，本研究擬通過動物實驗探索其抗炎機制及其與腎臟保護的相關性。

1　材料與方法

1.1實驗動物與藥材雄性SPF級SD大鼠60只，6～8周齡，體質量150～200 g，購自武漢大學動物實驗中心［許可證號：SCXK（鄂）2014-0004］。當歸補血湯由黃芪、當歸按1∶1配方（前期研究提示此為治療DN最優配比），藥材購自湖北省中藥材公司，黃芪、當歸生藥浸水1 h，煮沸40 min，重煎2次，合并煎煮液，濃縮后置4℃冰箱備用；格列奇特緩釋片（法國施維雅）。

1.2儀器與試劑超凈工作臺（蘇凈安泰）；全自動生化分析儀（Toshiba日本東芝公司），倒置光顯微鏡（Olympus日本），H-600透射電子顯微鏡（日立公司），LKB-V型超薄切片機（瑞典Bromma公司），臺式高速冷凍離心機（TGL-16），基因擴增儀（TC-XP杭州博日科技），實時熒光定量PCR儀（Life technologies: StepOneTM Real-Time PCR System）。生化檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），酶聯免疫吸附測定試劑盒（Elabscience Biotechnology）；定量PCR試劑盒（Toyobo），鏈脲佐菌素（Sigma）。

1.3實驗分組及造模所有實驗動物在武漢大學中南醫院動物實驗中心（SPF級）飼養實驗，隨機選取10只作為正常對照組（N），喂以普通飼料，其余大鼠以高脂飼料喂養。適應性喂養5 d后，禁食12 h，除N組外1次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60 mg/kg（溶于1%檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.3）建立糖尿病模型，N組注射等量檸檬酸鈉緩沖液。1周后大鼠尾靜脈采血測血糖，以血糖濃度大于16.7 mmol/L為造模成功［4］，隨機選取40只納入實驗，按隨機數字表法隨機分為糖尿病腎病對照組（DN組，生理鹽水10 mL/kg）、格列奇特組［GT組，格列齊特緩釋片2.68 mg/（kg·d）］、當歸補血湯低劑量組 ［DL組，1.79 g/（kg·d）當歸補血湯濃縮液］、當歸補血湯高劑量組［DH組，7.14 g/（kg·d）當歸補血湯濃縮液］，每組10只，灌胃處理。正常對照組（N組）以生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃。所有大鼠連續灌胃8周后取材。

1.4指標檢測及方法

1.4.1一般狀態及生化指標觀察大鼠飲水量、進食量、精神、毛色、有無感染等。灌胃8周后以代謝籠收集24 h尿液，并記錄尿量。稱質量后無菌條件下給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，腹主動脈采血，分離血清備用。酶偶聯比色法檢測血糖（GUL）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、血肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、尿素氮（BUN），并計算內生肌酐清除率（Ccr）：Ccr=［（尿肌酐濃度μmol/L×尿量mL/min）/血漿肌酐濃度μmol/L］×1 000。

1.4.2大鼠腎臟組織作光鏡、電鏡及圖象分析無菌條件下摘取雙腎，除去包膜，預冷生理鹽水洗凈拭干后稱質量，計算腎指數。切取約5 mm×5 mm大小皮質置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規行過碘酸雪夫氏（PAS）染色，光鏡10×20倍視野下觀察腎小球結構變化。另取小塊腎皮質剪碎用1.25%戊二醛固定，待行透射電鏡觀察腎臟超微結構。

1.4.3實時熒光定量PCR檢測NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達情況總RNA的提取按試劑盒說明操作，滅活RNA酶環境下進行，并用核酸測定儀檢測RNA濃度及純度。逆轉錄反應條件：65℃5min，42℃30 min，80℃5 min，完成后-20℃保存。PCR擴增引物由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中國公司合成，見表1。預變性95℃，1 min；循環（40次）：95℃15 s→58℃20 s→72℃20 s；末段延伸：72℃5 min；溶解曲線：72℃→95℃，每20 s升溫1℃。分別取PCR產物和β-actin擴增產物各10 μL混均后行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）做熒光指示劑，然后應用自動凝膠成像分析系統進行吸光度掃描，測得數據用2-ΔΔCt法分析基因表達。每組隨機選取6個樣本，各設置3個平行孔，結果取平均值。

1.4.4酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測微量白蛋白尿（MAU）、NF-κB、MCP-1蛋白含量實驗設立空白孔、標準孔、樣品孔，在各孔中加入標準品或樣品各100 μL，37℃孵育90 min，倒去孔內液體，加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，洗滌3次，加入100 μL酶結合物工作液，37℃孵育30 min，洗滌5次，加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min左右，加入50 μL終止液，立即在450 nm波長處測量A值。

1.5統計學處理采用SPSS19.0軟件進行分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　引物信息

2　結果

2.1一般情況實驗過程中DN組大鼠死亡2只（分別死于極度消瘦和感染），DH組死亡1只（灌胃事件），GT組死亡3只（1只原因未明，2只死于感染）。造模3 d即可見大鼠飲水量、尿量明顯增多。N組大鼠皮毛光澤，動作自如，反應靈敏；DN組大鼠毛色濕黃、無光澤，精神萎靡、反應遲鈍，這一情況在藥物干預組得到改善，DH組改善較明顯。

2.2體質量及腎指數改變N組大鼠體質量隨月齡增加不斷增長，DN組大鼠體質量明顯低于正常大鼠，差異有統計學意義（P＜0.01），GT組大鼠體質量較之造模前無明顯改變，與DN組之間無差異，DH、DL組大鼠體質量稍增加，較之DN組差異有統計學意義（P＜0.01或0.05）。造模組大鼠腎指數顯著高于N組，差異有統計學意義（P＜0.01），但各造模組間差異無統計學意義，見表2。

2.3當歸補血湯對大鼠血糖、血脂及腎功能的影響DN組大鼠GLU、TG、TC、BUN、Scr、MAU較N組均有顯著增高，而Ccr降低，差異有統計學意義（P＜0.01），干預后各組大鼠GLU、TG、TC、BUN、Scr、MAU降低，Ccr增高（P＜0.01或0.05）。GT組GLU明顯降低，較之DH、DL組差異有統計學意義（P＜0.01），TG、TC、BUN、Scr低于DL組，而Ccr升高，差異有統計學意義（P＜0.01或0.05）。DH組Scr較之N組無明顯差異，Ccr升高較之N組差異有統計學意義（P＜0.05），BUN低于GT、DL組（P＜0.01）。MAU 在GT組明顯高于DH、DL組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2、表3。

2.4光鏡、電鏡下腎臟結構變化N組大鼠光鏡下腎組織結構完整（圖1A）。DN組腎臟結構損傷嚴重，光鏡下可見腎小球基底膜（GBM）增厚，系膜基質增生明顯，蘇木精-伊紅（HE）染色呈強陽性，部分可見腎小球結節性硬化，腎小管上皮細胞腫脹變性，官腔變窄，腎間質部分小血管玻璃樣變性（圖1B）。GT、DL組大鼠可見腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜基質輕度增生（圖1C、圖1D）；DH組明顯改善，僅見腎小球輕度水腫，無明顯增生性病變（圖1E）；3組腎小管光鏡下均未見異常改變。電鏡下N組可見系膜細胞足突相互交錯排列成柵欄狀，基底膜厚度適中，結構完整，排列整齊（圖2 A）。DN組大鼠GBM均質性增厚，足細胞排列紊亂且發生融合，足突間隙變大，系膜基質增多，腎小管上皮細胞腫脹變性，部分可見細胞脫落，小管基底膜明顯增厚，線粒體增大變圓，線粒體嵴脫落（圖2 B）。GT、DL組病變減輕，GBM輕度增厚基質增多（圖2 C、圖2D），DH組明顯改善（圖2 E）。

表2　大鼠體質量、腎指數、血糖、血脂變化（±s）

表2　大鼠體質量、腎指數、血糖、血脂變化（±s）

注：與N組比較，*P＜0.01；與DN組比較，#P＜0.01，##P＜0.05；與GT組比較，△P＜0.01。

組別N組DN組GT組DL組DH組n 10 8 7 1 0 9體質量（g）　腎指數（×1 000）　GLU（mmol/L）　TG（mmol/L）　TC（mmol/L）518.80±4.21　11.12±0.27　5.07±0.61　1.13±0.10　0.83±0.10 217.00±3.74*　21.59±0.21*　27.41±0.96*　4.14±0.12*　2.14±0.10* 218.71±2.50*　21.41±0.18*　9.92±0.52*#　2.26±0.11*#　1.27±0.10*#221.70±5.01*##　21.51±0.20*　15.71±0.60*#△　3.91±0.18*#△　2.05±0.07*##△234.11±6.37*#△　20.44±0.10*　11.72±0.69*#△　2.40±0.15*#　1.35±0.08*#

表3　大鼠MAU及腎功能變化（±s）

表3　大鼠MAU及腎功能變化（±s）

注：與N組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與DN組比較，#P＜0.01；與GT組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05。

組別　n　MAU（mg/L）　BUN（mmol/L）　Scr（μmol/L）　Ccr（×1 000）N組　10　0.76±0.05　11.48±0.60　5.12±0.60　102.91±2.14 DN組　8　1.50±0.03*　27.81±0.49*　13.98±0.77*　56.20±3.63* GT組　7　1.31±0.03*#　18.77±0.45*#　6.41±0.64*#　97.57±1.86*#DL組　10　1.26±0.03*#△△　19.45±0.78*#△△　8.27±0.57*#△　86.76±1.92*#△DH組　9　1.02±0.04*#△　16.09±0.62*#△　5.56±0.48#△　105.90±3.20**#△

圖1　光鏡下腎臟結構改變PAS染色（×200）

圖2　電鏡下腎臟結構改變枸櫞酸鉛染色（×2 000）

2.5大鼠腎組織NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達變化PCR擴增結果顯示，DN組大鼠腎組織中NF-κBp65、MCP-1轉錄活性明顯增強，分別為正常大鼠的（2.66±0.20、3.4±0.25）倍，藥物治療組較DN組明顯減低，差異均有統計學意義（P＜0.01），DH組NF-κBp65 mRNA為（1.32±0.10），較之GT組（1.47± 0.10）差異無統計學意義（P=0.58），DL組（1.64± 0.12）高于GT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DH 組MCP-1 mRNA表達為N組的（1.35±0.11）倍，較之GT、DL組（1.61±0.12、1.71±0.19）差異有統計學意義（P＜0.05和0.01），GT、DL組之間差異無統計學意義。見圖3。

圖3　大鼠腎組織NF-κB p65、MCP-1mRNA表達變化

2.6大鼠腎組織中NF-κB、MCP-1蛋白表達變化在N組腎組織中存在一定量的NF-κB、MCP-1蛋白表達，DN組大鼠腎組織中NF-κB、MCP-1蛋白含量顯著增加，較之N組差異有統計學意義（P＜0.01）。DH組NF-κB、MCP-1含量明顯降低，較之GT、DL組差異均有統計學意義（P＜0.01），GT、DL組NF-κB含量差異無統計學意義（P＞0.05），GT組MCP-1低于DL組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4　大鼠腎組織NF-κB、MCP-1蛋白含量變化（±s）

表4　大鼠腎組織NF-κB、MCP-1蛋白含量變化（±s）

注：與N組比較，*P＜0.01；與DN組比較，#P＜0.01；與GT組比較，△P＜0.01。

組別N組DN組GT組DL組DH組n 10 8 7 1 0 9 NF-κB濃度（ng/L）　MCP-1濃度（μg/L）50.41±1.87　0.41±0.010 70.57±2.55*　0.65±0.010* 62.71±1.64*#　0.56±0.007*#60.98±2.31*#　0.59±0.010*#△53.12±1.47*#△　0.49±0.007*#△

3　討論

DN是糖尿病最常見的微血管并發癥，也是糖尿病患者最主要的死亡原因之一，其病理機制復雜，糖尿病時各種內環境改變如糖脂代謝紊亂、高血壓、血流動力學異常、氧自由基、糖基化終末產物等均參與了DN的發生發展。近年來針對DN發生的分子機制的研究不斷深入，炎癥在DN發展中的作用受到重視，許多學者提出炎癥反應可能是這些致病因素作用的關鍵環節。已證明在DN患者腎組織中存在多種炎癥細胞浸潤和血清C反應蛋白（CRP）、炎癥因子增加［3］，而在有DN病史的化療患者中，微炎癥更是普遍存在［5］。DN的主要病理改變為腎小球硬化和間質纖維化，研究表明腎臟纖維化與炎癥時巨噬細胞浸潤及炎癥因子增加密切相關，炎癥因子可激活損傷部位的成纖維細胞并誘導腎臟固有細胞如系膜細胞、腎小球和腎小管上皮細胞等向肌成纖維細胞轉化，導致大量細胞外基質成分產生和沉積［6-7］，從而推動纖維化進程。炎癥還可造成腎小球內皮損傷及功能障礙［8］，誘導足細胞等腎臟固有細胞凋亡，促進蛋白尿的發生［9］。

核因子κB（NF-κB）是一種重要的核轉錄因子，廣泛存在于各種細胞中，參與細胞內的信號傳遞，調控多種基因的表達，NF-κB信號轉導通路被認為是炎癥時內皮細胞激活的關鍵［2］。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IkB結合以無活性的形式存在于細胞質中，細胞受到刺激時可通過多種途徑激活NF-κB，活化的NF-κB轉位到核內與其相關的DNA序列結合誘導靶基因的轉錄［10］。NF-κB是一種二聚體復合物，p65是組成NF-κB二聚體的主要家族成員之一，NF-κB活化時，IkB與p65亞單位解離，此時p65可被檢測到，因此本實驗以NF-κBp65作為NF-κB的活性標志。單核細胞趨化蛋白-1 （MCP-1）是受NF-κB調節的炎性趨化因子之一［11］，是誘導血液中單核-巨噬細胞在炎癥部位聚集和活化的關鍵，而巨噬細胞是腎臟重構的主要參與者［12］。研究發現在高糖培養下的系膜細胞和內皮細胞，NF-κB、MCP-1的活性及表達明顯增加，而通過抑制腎臟NF-κB活性及表達，減少MCP-1的產生及巨噬細胞浸潤，可有效改善腎臟炎癥狀態，緩解DN腎臟損傷［11，13］。

本實驗研究發現，在造模8周后，DN組大鼠出現腎功能下降、蛋白尿等異常，腎臟鏡下可見腎小球基底膜（GBM）增厚，系膜基質增生，腎小球結節性硬化等明顯的DN改變。同時腎組織NF-κB、MCP含量顯著增加，mRNA活性增強，再次驗證了在DN中存在炎癥反應。格列齊特為T2DM的一線治療藥物，可有效降低糖尿病患者血糖、血脂，改善代謝紊亂，有研究證明其可減少糖尿病患者血清急性時相反應蛋白、白介素、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子水平，具有抗炎效應［14-15］。本實驗中經過格列齊特處理后大鼠血糖、血脂顯著降低，腎臟病理損傷減輕，腎功能得到一定改善，腎組織炎癥因子NF-κB、MCP-1也明顯低于DN組，提示格列齊特抗炎作用可能與其抑制NF-κB/MCP-1信號通路有關。值得提出的是GT組MAU高于DL、DH組，且其改變與腎功能無明顯相關性，提示MAU的發生可能存在其他機制的參與，有研究認為蛋白尿為DN發生及進展的獨立危險因素［16-17］，本研究結果在一定程度上支持此觀點，其具體機制尚有待進一步探討。

糖尿病在中醫屬于“消渴病”的范疇，其病機在于陰津虧損，燥熱偏盛，DN多發生在糖尿病的后期階段，此時多見氣陰兩傷或氣血陰陽俱虛。當歸補血湯由黃芪和當歸兩味藥組成，具有補氣生血的功效，與DN的病機相一致。課題組前期研究證明，當歸補血湯可抑制腎臟系膜細胞增生及細胞外基質積聚，減輕腎小管—間質損傷，減少尿白蛋白，起到抗纖維化作用［18-19］。本實驗發現經當歸補血湯治療后，大鼠血糖、血脂顯著降低，腎功能改善，蛋白尿減輕，腎臟鏡下病理改變亦明顯減輕，且DH組明顯優于DL組，提示當歸補血湯具有較好的腎臟保護作用并具有一定的劑量依耐性，而腎組織中NF-κB、MCP-1含量明顯下降，NF-κBp65、MCP-1 mRNA活性也顯著受抑，并與腎功能改變具有一致性，證實當歸補血湯可降低NF-κB、MCP-1炎癥因子的表達，抑制腎臟炎癥反應，減輕DN腎臟損傷。

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中圖分類號：587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9043（2016）03-0167-06

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.06

收稿日期：（2016-02-21）

*基金項目：國家自然科學基金資助項目（81373793）。

作者簡介：王秀萍（1990-），女，碩士研究生，研究方向為中西醫結合內分泌專業。

通訊作者：張瑩雯，E-mail：hhao3838@sina.com。

Effect of Astragals and Angelica Mixture on renal expression of NF-κB and MCP-1 in rats with diabetic

WANG Xiu-ping，REN Xiao-dan，ZHANG Ying-wen
（The Second Clinical College of Wuhan University，Wuhan 430030，China）

Abstract:［Objective］To investigate the anti-inflammation mechanism of Astragals and Angelica Mixture with an influence on the expression of inflammatory factors NF-κB and MCP-1，and its correlation with renal protective effect.［Methods］Using STZ+high-fat diet to establish animal models of DN.Enzyme coupling colorimetric method to detect the serum glucose，lipids and the renal function related parameters.Kidney structure change was observed under the light and electron microscope，Enzyme-linked immune sorbent assay to detect the protein content of NF-κB and MCP-1 in the kidney.Real-time fluorescent quantitative PCR to measure the change of NF-κB and MCP-1 mRNA expression.［Results］The protein and mRNA expression of NF-κB and MCP-1 in DN rats kidney was significantly increased.After treated with Astragalus and Angelica Mixture，the renal function was improved，kidney protein and mRNA expression of NF-κB，MCP-1 was significantly reduced.［Conclusion］Astragals and Angelica Mixture can effectively decrease the protein and mRNA expression and activity of NF-κB and MCP-1 in DN rats kidney，ameliorate kidney damage，have a anti-inflammation effect.

Key words:astragals and angelica mixture；diabetic nephropathy；inflammation；NF-κB；MCP-1