羰基氰氯苯腙調節非經典自噬的機制研究

高瑛，劉亞軍，蔡欣然，劉培慶，李民

(中山大學 藥學院/新藥成藥性評估與評價國家與地方聯合工程實驗室，廣州 廣東 510006)

羰基氰氯苯腙調節非經典自噬的機制研究

高瑛，劉亞軍，蔡欣然，劉培慶Δ，李民Δ

(中山大學 藥學院/新藥成藥性評估與評價國家與地方聯合工程實驗室，廣州 廣東 510006)

目的 探討可以調控羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)誘導的不依賴自噬關鍵基因的非經典自噬的影響因素。方法 分別將野生型細胞和自噬關鍵基因敲除/敲低的細胞(Atg5-KO MEF，FIP-200 KO MEF，ULK1-KO MEF，Beclin 1-KO U251)用CCCP 處理，觀察GFP-LC3的分布聚集情況和LC3蛋白水平的表達。熒光定量PCR檢測CCCP處理后LC3B mRNA水平變化。Western blot檢測FIP200-KO MEF中CCCP 處理時，水通道蛋白抑制劑對LC3 蛋白水平的影響。結果 在Atg5-KO MEF細胞中，和對照組相比，CCCP 處理組免疫熒光實驗不能產生GFP-LC3 自噬斑點，Western blot結果顯示LC3-I 型不能轉變為LC3-II。而在ULK1-KO MEF，FIP200-KO MEF，及Beclin1-KD U251細胞中，CCCP 處理組免疫熒光實驗能產生GFP-LC3自噬斑點，同時LC3-I 型也能轉變為LC3-II型。但CCCP 處理不影響LC3B的mRNA水平。CCCP 誘導的非經典自噬能被水通道蛋白抑制劑所抑制。結論 CCCP 誘導的非經典自噬需要自噬關鍵基因Atg5 參與，但不需要Beclin 1，ULK1，FIP200的參與，不影響LC3B 的轉錄調控。滲透壓不平衡可以調節CCCP誘導的自噬。

自噬；滲透壓不平衡；羰基氰氯苯腙；LC3； MEF

自噬(巨自噬)是對細胞內衰老細胞器、長壽命蛋白以及外源病原微生物進行吞噬然后與溶酶體融合并降解內含物的過程，其在進化過程中具有高度保守性[1]。已有大量研究報道自噬與腫瘤、神經退行性疾病、感染免疫等多種疾病密切相關[1-3]。近年來發現自噬體的形成可以不經過某些經典自噬的步驟，抑或是不依賴于某幾個經典自噬相關蛋白，被稱為非經典自噬[4]。這些經典自噬的替代通路增加了自噬分子機制研究的復雜性，同時也為與經典自噬缺陷相關的疾病治療提供了新的可能。

羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)是一個脂溶性的弱酸以及強線粒體解偶聯劑，可提高線粒體內膜的質子滲透性[5]。CCCP 目前作為線粒體自噬研究的常用工具化合物，可以改變線粒體膜電位和使線粒體去極化，并被認為可誘導自噬以清除被去極化的線粒體[6]。本課題組之前研究發現CCCP可以誘導非經典自噬[7]。本文旨在對CCCP誘導的非經典自噬機制進行深入探究，為與經典自噬缺失的相關疾病提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：WT MEF細胞、FIP200-KO MEF細胞、Atg5-KO MEF細胞、ULK1-KO MEF細胞、Beclin1-KD U251細胞均由本實驗室保存，穩定轉染GFP-LC3質粒的各種細胞由本實驗室保存[8]。

1.1.2 主要試劑：CCCP(215911)購自德國Merck 公司。AgNO3(204390)和Phloretin(P7912)購自美國Sigma-Aldrich 公司。GAPDH(sc-365062)購自美國Santacruz公司。LC3(L7543)、tubulin(T6074)購自美國Sigma-Aldrich公司。Cocktail protease和HRP-偶聯二抗購自美國Thermo Scientific。Trizol購自美國Invitrogen。RT-PCR試劑盒購自中國大連寶生物公司。

1.1.3 儀器：熒光顯微鏡EVOS FL Auto(Life Technologies，美國)；雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，中國)；CO2培養箱(Thermo，美國)；酶標儀(BioTek，美國)；ImageQuant LAS 4000mini(GE，美國)；蛋白電泳、電轉系統(Bio-Rad，美國)。IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將穩定轉染GFP-LC3 的WT、Atg5-KO、ULK1-KO、和FIP200-KO的MEF細胞以及Beclin1-KD的U251細胞，培養于含有10%胎牛血清(Invitrogen，10099-141)的DMEM(Thermo Scientific，SH3024301) 培養液中，于37 ℃，5% CO2的孵箱中培養。

1.2.2 Western blot 法檢測蛋白表達：提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白含量，上樣量為30 μg，將蛋白變性，采用12% SDS 分離膠和5%濃縮膠進行電泳，電泳結束后轉移至PVDF 膜(Bio-Rad)，室溫封閉1 h后孵一抗(1:1000)4 ℃過夜。漂洗后加入二抗(1:5000)，室溫孵育1 h，化學發光試劑增強反應，ImageQuant LAS 4000mini 顯影成像。

1.2.3 細胞圖像分析：將培養在96孔板穩定轉染GFP-LC3的細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗2遍，再加入PBS緩沖液，EVOS FL Auto(Life Technologies)熒光顯微鏡拍照。每孔至少選擇3個視野50個細胞計算熒光斑點的個數。每個實驗重復3遍。

1.2.4 熒光定量PCR：Trizol 提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA 濃度和純度。參照RT-PCR 試劑盒說明書進行逆轉錄反應。按照SYBR Green說明書反應體系加入熒光染料、引物和RT產物后在Bio-Rad IQ5 PCR儀中進行real-time PCR反應。 LC3B上游引物：5’-CCC ACC AAG ATC CCA GTG AT-3’，LC3B下游引物：5’-CCA GGA ACT TGG TCT TGT CCA-3’， β-actin上游引物：5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’，β-actin下游引物：5’-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3’。所有引物由英濰捷基公司合成。

2 結果

2.1 CCCP 誘導的LC3 脂質化需要自噬關鍵基因Atg5 參與 在WT MEF 細胞中，用CCCP 處理細胞后，和對照組相比，CCCP 組能產生很多GFP-LC3的熒光小點，與Western blot 實驗結果一致。說明LC3 脂質化，CCCP誘導了自噬的發生。在Atg5-KO MEF細胞中，CCCP不能誘導產生GFP-LC3 的熒光小點(見圖1)，說明CCCP誘導LC3脂質化時需要Atg5的參與。

圖1 CCCP誘導的自噬需要Atg5參與A：WT MEF和Atg5-KO MEF在完全培養基(CM)和CCCP(30 μM，6 h) 處理后GFP-LC3熒光小點的細胞圖像分析，bar=10 μm；B: Western blot 檢測相應的LC3-I和LC3-II的表達Fig.1 CCCP induced autophagy dependent of Atg5A:WT MEF, Atg5-KO MEF cells stably expressing GFP-LC3 were treated with complete medium(CM)or 30 μM of CCCP for 6 h. Fluorescent images were analyzed, bar=10 μm;B:Expression level of LC3-I and LC3-II of cell lysates were detected by Western blot

2.2 CCCP誘導非經典自噬不需要自噬關鍵基因ULK1、FIP200以及Beclin1的參與 在Beclin1-KD U251 細胞中，CCCP處理能誘導細胞產生GFP-LC3的熒光小點。在ULK1-KO MEF和FIP200-KO MEF細胞中，CCCP處理也能誘導細胞產生GFP-LC3的熒光小點。Western blot結果顯示，在上述3種細胞中CCCP處理均能使LC3-I型轉變為LC3-II，且比未處理組增加明顯，見圖2。說明CCCP誘導的非經典自噬不需要自噬關鍵基因ULK1、FIP200 和Beclin1的參與。

圖2 CCCP誘導的自噬不依賴于Beclin 1、ULK1、FIP200A: Beclin 1-KD U251、ULK1-KO MEF以及FIP200-KO MEF在完全培養基(CM)和CCCP(30 μM，6 h)處理后GFP-LC3熒光小點的細胞圖像結果，bar=10 μm；B： Western blot 檢測相應的LC3-I和LC3-II的表達Fig.2 CCCP induced Beclin-1/ULK1/FIP200 independent autophagyA:Beclin 1-KD U251, ULK1-KO MEF, and FIP200-KO MEF cells stably expressing GFP-LC3 were treated with complete medium(CM)or 30 μM of CCCP for 6 h bar=10 μm;B:Expression level of LC3-I and LC3-II of different cell lysates were detected by Western blot

2.3 CCCP 誘導非經典自噬并不是通過影響LC3B的轉錄調控 在FIP200-KO MEF細胞中CCCP能誘導非經典自噬，那么CCCP是否通過調控LC3的轉錄誘導非經典自噬。熒光定量PCR結果顯示，CCCP處理組(30 μM，6 h)和對照組相比，LC3B mRNA水平差異無統計學意義(見圖3)。說明在FIP200-KO MEF細胞中，CCCP并不影響LC3 的轉錄調控。

圖3 CCCP處理對LC3B mRNA水平的影響Fig.3 mRNA analysis of LC3B with or without CCCP treatment

2.4 CCCP 誘導的非經典自噬受滲透壓影響 Western blot結果顯示：在FIP200-KO MEF細胞中，CCCP 誘導的LC3脂質化可被水通道蛋白抑制劑Phloretin和AgNO3所抑制(見圖4)。水通道蛋白抑制劑可改變膜的滲透壓，這說明CCCP誘導非經典自噬可能受滲透壓的調節。

圖4 水通道蛋白抑制劑對CCCP誘導非經典自噬的影響A：FIP200-KO MEF中CCCP(30 μM，6 h)和水通道蛋白抑制劑Phloretin聯合使用對LC3 蛋白表達的影響；B：FIP200-KO MEF 在CCCP(30 μM，6 h)和水通道蛋白抑制劑AgNO3(2 μM，6 h)聯合使用對LC3 蛋白表達的影響**P<0.01Fig.4 Effect of water channel inhibitors on CCCP-induced non-canonical autophagyA: LC3 expression of FIP200-KO MEF cells treated with 30 μM of CCCP and 200 μM of Phloretin for 6 h;B: LC3 expression of FIP200-KO MEF cells treated with 30 μM of CCCP and 2 μM of AgNO3 for 6 h**P<0.01

3 討論

CCCP作為一個傳統強效的線粒體氧化磷酸化解偶聯劑，可促使線粒體內膜對H+產生通透性，導致線粒體內膜兩側的膜電位喪失，常被用于線粒體損傷以及線粒體自噬的研究[6,9]。LC3是自噬體最常用的標記物[10]，本文用LC3形成的斑點和LC3脂化形式LC3-II的增加作為自噬的檢測指標。不依賴于某些自噬相關基因的自噬，稱之為非經典自噬，如Atg5/Atg7 不依賴性自噬[11]，ULK1/ULK2不依賴性自噬[12]，Beclin1不依賴性自噬[13]。根據前人的報道，LAP(LC3相關吞噬)的發生不依賴于ULK1/2-ATG13-RB1CC1/FIP200經典自噬的起始復合物，但仍需依賴于自噬相關蛋白ATG5和ATG7[14]，LAP也屬于一種非經典自噬。近年關于自噬基因功能失調與一系列不同疾病的聯系的相關報道逐年增多，如Crohn’s disease 與ATG16L1基因的變異相關[15]。現已有研究報道LAP與抗菌、清除死細胞、抗癌、免疫等密切相關[16-19]，所以發現誘導非經典自噬的藥物以及研究非經典自噬的發生機制能為非經典自噬的生理功能奠定重要的基礎。本研究發現自噬關鍵基因Atg5的缺失可以阻斷CCCP 所誘導的自噬，同時發現CCCP誘導的自噬不能被自噬關鍵基因Beclin1、FIP200以及ULK1 所阻斷，說明CCCP可以誘導非經典自噬。研究還發現CCCP并不影響LC3本身的mRNA水平，也就是說CCCP 誘導非經典自噬并不影響LC3的轉錄調控。有研究報道，氯喹誘導LAP 時受滲透壓調節，滲透壓失衡可誘導LAP的LC3脂質化[16]。所以，用影響滲透壓的水通道蛋白抑制劑聯合CCCP處理，發現水通道蛋白抑制劑也能抑制CCCP引起的LC3脂質化，說明CCCP誘導的非經典自噬也受滲透壓調節。然而，CCCP誘導的非經典自噬是否受其他因素影響以及CCCP改變滲透壓的具體機制還需要進一步研究。本研究確證了CCCP可以誘導非經典自噬，并發現滲透壓失衡可能是調節該自噬的重要因素，拓寬了對CCCP功能的了解，為研究自噬發生過程與疾病的潛在聯系提供了新的調控思路。

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(編校：吳茜)

Mechanism of CCCP-induced non-canonical autophagy

GAO Ying, LIU Ya-jun, CAI Xin-ran, LIU Pei-qingΔ, LI MinΔ

(National and Local United Engineering Lab of Druggability and New Drugs Evaluation, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo identify the factors those regulate CCCP-induced non-canonical autophagy. MethodsDifferent cells expressing GFP-LC3 were treated with or without CCCP (30 μM) for 6 h. Fluorescent images were taken and cell lysates were analyzed by western blot assay. Real-time PCR was used to measure the mRNA levels of LC3B. FIP200-KO MEF cells were cultured and treated by 30 μM CCCP with or without water channel inhibitors, for 6 h. Cell lysates were analyzed by Western blot assay. ResultsCCCP could not induced autophagy in Atg5-KO MEF cells. CCCP could induce non-canonical autophagy in ULK1-KO MEF, FIP200-KO MEF, and Beclin1-KD U251. CCCP treatment in FIP200-KO MEF cells had no effect on the expression level of LC3B mRNA. We also found two distinct aquaporin water channel inhibitors could inhibit the generation of LC3 which was induced by CCCP. ConclusionCCCP induced non-canonical autophagy was Atg5-dependent, but Beclin1-, ULK1- and FIP200-independent. Osmotic imbalance could regulate CCCP-induce non-canonical autophagy.

Autophagy; osmotic imbalance; CCCP; LC3; MEF

廣東省自然科學基金(S2013010015876)；博士點基金(20130171120049)

高瑛，女，碩士在讀，研究方向：細胞自噬，E-mail：gaoyiying09@126.com；李民，通信作者，男，博士、副教授，研究方向：細胞自噬，E-mail：limin65@mail.sysu.edu.cn；劉培慶，共同通信作者，男，博士、教授，研究方向：心血管藥理，E-mail：liupq@mail.sysu.edu.cn。

R329.2+7

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.08