患者HPA 1-6，9，15基因多態性對血小板輸注無效的臨床意義

李園，曾惠， 吳海兵，趙曉燕，顏敏超，郭曉

(嘉興市第一醫院 血液科，浙江 嘉興 314001)

患者HPA 1-6，9，15基因多態性對血小板輸注無效的臨床意義

(嘉興市第一醫院 血液科，浙江 嘉興 314001)

目的 觀察人類血小板特異性抗原(human platelet alloantigens， HPA)1-6，9，15系統及其基因多態性與血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness， PTR)的研究。方法 選取40例血小板輸注無效患者的外周血標本和供者標本，對其進行血小板特異性糖蛋白抗體檢測，根據血小板回收率評判血小板輸注效果，采用聚合酶鏈式反應(PCR)結合直接測序方法，對供、患者進行HPA1-6，9，15抗原系統基因進行分型，動態觀察患者同型血小板輸注后血小板恢復百分率(percent platelet recovery，PPR)，探討HPA基因多態性和血小板輸注無效的關系。結果 患者和供者HPA-1、4、9均未檢測出HPA-b基因，呈呈aa純合子單態性分布；HPA-5、6則主要以aa純合子為多，較少看到bb純合子。而HPA-2、3、15呈明顯多態性分布，HPA-2、3、5、6、15等位基因頻率均呈多態性分布。結論 對反復多次發生血小板輸注無效的患者，除需考慮HLA基因相關外，還與HPA基因多態性相關。在做HPA配型時，多數人只需檢測供者與患者HPA2、3、15基因就可以顯著減少血小板輸注無效的發生。

血小板特異性抗原；基因多態性；血小板輸注無效；血小板恢復百分率

人類血小板特異性抗原(human platelet alloantigens， HPA)是血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，其主要表達于血小板膜糖蛋白上[1]。血小板膜糖蛋白基因迄今為止已有22中，這些基因具有單核苷酸多態性(SNP)[2]，從而導致HPA的多態性。且HPA基因頻率與種族、地域等關系密切[3]。若HPA不合則會導致機體產生血小板同種抗體進而引起免疫反應導致血小板損傷。其與輸血過程中可能出現的血小板輸注無效(PTR)、輸血后紫癜(PTP)等直接相關[4]。PTR是指臨床上應用血小板輸注進行治療時，患者血液內的血小板計數增加值顯著低于臨床預期或者患者再次出血現象甚至會由于血小板的破壞而危及生命[5]。血小板輸注是目前治療血小板減少及預防出血的主要方法，但可能會產生PTR，達不到理想的治療效果[6]。有研究表明[7]，引起PTR的主要為人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，但是HPA引起的PTR的嚴重程度顯著高于HLA。而引起PTR的HPA系統主要集中在HPA1-6，9，15[8]中。因此，本次研究主要集中于以上幾個系統。

為了對HPA1-6，9，15的基因多態性與PTR的發生情況進行研究，本次選取了40例PTR患者及供者作為研究對象，通過PCR和直接測序的方法對研究對象的外周血標本進行檢測，對HPA抗原系統進行分型，明確PTR與HPA抗原系統基因的聯系，為臨床合理治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取于2015年1月～2015.6來嘉興市第一醫院就診的血小板輸注患者40例，年齡23～84歲，平均年齡(45±17)歲，其中男性19例，女性21例。病例中包括免疫性血小板減少性紫癜16例，白血病16例，再生障礙性貧血4例，骨髓增生異常綜合癥患者3例，巨球蛋白血癥1例。所有患者均符合臨床血小板輸注無效的診斷。納入標準：①經臨床診斷及輔助檢查確認為血小板輸注無效患者;②HIV抗體陰性患者;③排除了患者與供者由于HLA類抗體導致的PTR；排除標準：①彌散性血管內凝血(DIC)、敗血癥、脾腫大及輸注前后6 h體溫38.5者;②血小板輸注前24 h服用兩性霉素B、萬古霉素者及輸注前1個月內輸注靜脈免疫球蛋白者;③在檢測血小板輸注后24 h PPR之前又輸注其他血液者。供血者來源于嘉興中心血站提供的血液樣本。所有患者及其家屬均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑：HPA Ready Gene Plus 試劑盒(德國 inno-train 公司)；DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；Taq酶(Promega 公司)；PCR擴增儀(美國ABI9700)；ELX型通用酶標儀(美國Bio-Tak公司)；低溫高速離心機(BECKMAN 64R)，凝膠成像儀(美國 Bio-Rad)，瓊脂糖凝膠電泳儀(江蘇盛藍儀器制造有限公司)。

1.2.2 實驗步驟：取患者外周靜脈抗凝血5 mL，按照QIAGEN公司的DNA提取試劑盒說明書進行微注法DNA的提取，測定其濃度。根據HPA1-6，9，15系統的基因序列設計相應的引物并進行PCR擴增，擴增條件為94 2 min 進行變性，94 ℃ 15 s、65 ℃ 60 s進行10個循環，94 ℃ 15 s， 61 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s的條件進行20個循環，4延伸15 min。取PCR擴增產物5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并于紫外凝膠成像儀中進行分析。對所有合格的PCR產物進行直接測序，并與HPA1-6，9，15系統的基因序列進行比對，盡可能挑出覆蓋HPA1-6，9，15系統抗原的血小板細胞。

1.2.3 血小板輸注療效判定標準：臨床上一般用血小板恢復百分率(PPR)和輸注后血小板計數糾正增加指數(CCI)作為血小板輸注效果評價指標[9]。輸注24 h后，若PPR20%或者CCI<10則認為血小板輸注無效(PTR)[10]。

2 結果

2.1 患者與供者HPA 1-6，9，15 抗原相合與否與發生PTR的臨床觀察 對40例輸注無效的患者和36名健康獻血者進行HPA1-6，9，15抗原分型及匹配，結果發現40例發生PTR的患者中，有39例患者與供者的HPA分型不合，占97.5%，顯著高于患者與供者HPA分型相合時發生的PTR比例(2.5%)，且差異具有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 供患雙方HPA分型情況與臨床PTR發生率的相關性比較

**P<0.01，與HPA分型不合患者相比，compared with for both sides with HPA classification incompatibility

2.2 患者與供者HPA系統中基因的多態性分布 對患者和供者的HPA1-6，9，15系統及其基因分布進行分析研究，PCR結果見圖1、圖2。

圖1 患者HPA1-6，9，15基因檢測結果Fig.1 Results of patient HPA1-6, 9, 15 gene test

圖2 供者HPA1-6，9，15基因檢測結果Fig.2 Results of donor HPA1-6, 9, 15 gene test

對PCR結果進行統計分析發現，患者與供者的HPA 1、4、9均未發現HPA-b基因，均呈aa純合子單性態分布；HPA 5、6則主要以aa純合子為多，極少能夠發現bb純合子；HPA2、3、15則呈現明顯的多態性分布。且HPA 2、3、5、6、15等位基因頻率均呈現多態性分布，其中，HPA 3、15的雜合度最高，而b等位基因的頻率則以HPA 15 為最高(0.569)，其次為HPA 3(0.458)和HPA 2(0.097)。具體結果見表2、3。

表2 患者HPA 1-6，9，15等位基因分布情況

表3 供者HPA 1-6， 9， 15等位基因分布情況

綜上分析，HPA1-6，9，15等位基因中，HPA2，3，15呈現出較明顯的基因多態性分布情況，若在輸血過程中僅關注血型的匹配，則極有可能因這些基因的多態性分布而導致患者產生嚴重的血小板輸注無效的情況，若能很好的控制供患雙方這些基因的匹配度則可能極大的減少血小板輸注無效的發生率，具有極強的臨床意義。

3 討論

血小板輸注是臨床上治療血小板減少和預防出血的重要方法，但是其可能會導致血小板輸注無效(PTR)。導致PTR的原因有多種，包括自身免疫性疾病、部分抗生素的使用、ABO血型抗原、HLA抗體、HPA抗體等[11]。在我國大部分地區，對患者進行輸血時僅考慮了ABO血型這一因素[12]，因此臨川上血小板輸注效果并不理想。研究發現，在免疫性致病因素中，HLA占80%，HPA因素占11.7%[13]，2者約占所有病因的16.2%，不容忽視，而HPA不匹配導致的PTR反應可能會更嚴重。HPA不合的輸注可以導致機體產生血小板同種的抗體從而引起血小板破壞，并且不合度越高，產生PTR的嚴重程度越高[14]。臨床上在進行血小板輸注的時候，選擇與患者HLA和HPA均匹配的血小板或許是減少發生PTR的有效方法之一。

為了研究HPA1-6，9，15系統中基因多態性對血小板輸注無效的臨床意義，本研究選取了血小板輸注無效患者，采用PCR和直接測序相結合的方法對患者和供血者外周血進行測試，并對HPA1-6、9、15系統等位基因進行分型。研究結果發現，PTR患者中HPA分型不合占97.5%，顯著高于HPA分型相合的患者(2.5%)，從一定程度上提示患者和供血者的HPA分型相合有助于減少PTR的發生率。對HPA1-6、9、15系統等位基因多態性的分布中發現，患者和供者血清中HPA 2、3、15呈現出較明顯的多態性分布，且HPA 2、3、5、6、15等位基因頻率均呈現多態性分布，其中，HPA 3、15的雜合度最高，這也與其他一些研究相符合[15-16]，提示：這些系統基因分布的不合的比例很高，很可能是造成PTR產生的重要原因。

綜上所述，在進行血小板輸注時，除需考慮ABO血型相匹配外，HLA和HPA基因的匹配也應納入選擇標準，而做HPA配型時，多數患者只需檢測供者和受者的HPA2 、3、15基因即可顯著減少血小板輸注無效的發生。這樣既可以減少成本又能夠提高治療效率。但是，本次研究納入的研究對象僅有40例，并且僅局限于一個地區，由于HPA在人群中的分布情況與地域、人種等均有較密切的關系，因此還需納入更多的研究樣本進行分析才能得出更加準確的結論，為臨床治療提供有效的參考數據。

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(編校：譚玲)

Research on the clinical value between gene polymorphism of HPA 1-6,9,15 and platelet transfusion refractoriness

LI Yuan， ZENG Hui， WU Hai-bin， ZHAO Xiao-yan， YAN Min-chao， GUO Xiao-junΔ

(Department of Hematology, The First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314001, China)

ObjectiveTo research the clinical value between gene polymorphism of human platelet alloantigens (HPA) 1-6, 9, 15 and platelet transfusion refractoriness (PTR). MethodsTotally 40 patients with platelet transfusion refractoriness(PTR) were randomly selected, and patients and donors’ peripheral blood specimens were collected and tested these samples with platelet GP specific antibodies, and judged the results of platelet transfusion, and with the help of the combination of PCR and direct sequencing for classification of HPA 1-6,9,15 antigens and observe the percent platelet recovery(PPR) after the same type of platelet transfusion, and explore the relationship between HPA gene polymorphism and PTR. ResultsThere was no HPA-b gene was found neither on patients and donors’ HPA 1,4,9, showed the distribution of aa homozygous form; HPA 5,6 were mainly aa homozygous form, little bb homozygous form was discorvered. And HPA 2,3,15 were distributed of polymorphism, the frequency of HPA 2,3,5,6,15 were found with polymorphism. ConclusionFor these patients who were happened with PRT many times, in addition to taking HLA into account, HPA gene polymorphism are also need to be considered. Most people only need to test patients and donors’ HPA2,3,15 gene to decrease the occurrence of PTR significantly when making HPA matching.

human platelet allogntigens; gene polymorphism; platelet transfusion refractoriness; percent platelet recorvery

浙江省嘉興市科技計劃(2013AY21042-8)

李園，女，本科，主治醫師，研究方向：血小板抗體與輸血，E-mail：anne_263@sina.com；郭曉珺，通信作者，女，本科，主任醫師，研究方向：血小板抗體與輸血，E-mail：jxzzxgxj@163.com。

R475.11

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.55