復方醋酸地塞米松乳膏抑菌劑含量測定及其抑菌效力評價

林琳

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，老年病教研室，黑龍江 哈爾濱 150000)

復方醋酸地塞米松乳膏抑菌劑含量測定及其抑菌效力評價

林琳Δ

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，老年病教研室，黑龍江 哈爾濱 150000)

目的 建立高效液相色譜法測定復方醋酸地塞米松乳膏中抑菌劑的含量, 并評價抑菌劑使用的合理性。方法 采用HPLC方法，以外標法測定羥苯乙酯含量。參照《中國藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法；采用大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉共5 種試驗菌株進行抑菌劑效力測定。結果 羥苯乙酯在6.63～132.6 μg/mL濃度范圍內呈良好線性關系Y=4 216.2X+0.320 8，r=0.999 7，平均回收率為99.2%。不同批次的供試品的抑菌效力因抑菌劑含量不同而效果不一。結論 本方法結果準確,重復性好,可用于復方醋酸地塞米松乳膏中羥苯乙酯含量的測定。目前抑菌劑的使用存在隨意性,需加強研究和監管。

復方醋酸地塞米松乳膏；羥苯乙酯；含量測定；抑菌效力

復方醋酸地塞米松乳膏為皮膚外用藥，具有抗炎、抗過敏的作用，因其適用于各種皮炎、濕疹等常見病[1-3]，且療效迅速確切，深受患者歡迎，其質量標準收載于《中國藥典》2015年版二部[4]。不同于口服制劑，軟膏劑多為多劑量包裝，在使用過程中，不可避免的接觸外來物，為了防止污染，多數制劑中都添加適宜的抑菌劑。通過調查發現市售多個廠家不同批次的復方醋酸地塞米松乳膏中都使用羥苯乙酯(尼泊金乙酯)作為抑菌劑，但處方中均未給出具體含量。本文采用HPLC法測定復方醋酸地塞米松乳膏中羥苯乙酯的含量，然后對不同含量抑菌劑的樣品進行抑菌劑效力測定，對樣品中抑菌劑添加量使用的合理性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：羥苯乙酯對照品(100847-201203，純度100%，購自中國食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。菌種:細菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B) 10104]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B) 44102]，真菌包括白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F) 98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F) 98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院，菌種傳代3次后使用。

培養基：沙氏葡萄糖液體培養基(SDB)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液均購自北京陸橋技術股份有限公司。各培養基經適用性試驗，結果全部符合《中國藥典》2015年版相關要求。

1.1.2 實驗儀器：1260型全自動高效液相色譜儀配DAD檢測器(安捷倫)；AB304S型電子天平(上海梅特勒一托利多儀器有限公司)；BT-25S型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；TU1801紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；BSC-1300ⅡA2生物潔凈安全柜(上海蘇凈實業有限公司)；SPX-150B-Z型恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司)； BS210S電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]YXQ-LS-100A型立式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌劑含量測定方法

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，0.5μm)；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(35:65)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長為256 nm。

② 溶液的制備：精密稱取羥苯乙酯對照品13.26 mg,置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。取供試品內容物約2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，70 ℃水浴加熱，時時振搖，至樣品完全溶解，加甲醇稀釋至刻度，放冷，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后用0.22 μm微孔濾膜迅速濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

③ 線性關系考察：精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，用甲醇定容至10 mL，分別進樣，計算峰面積，以羥苯乙酯濃度(μg/mL)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。

④ 精密度考察：在①色譜條件下，精密吸取②對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，重復進樣6次。

⑤ 穩定性考察：取②項下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h時進樣。

⑥ 重復性考察：取②項下供試品溶液5份，分別精密吸取20 μL，按照色譜條件測定，結果羥苯乙酯峰面積的RSD為1.4%。

⑦ 回收率試驗：精密稱取復方醋酸地塞米松乳膏(批號)約2 g，共取9份，置50 mL量瓶中，按不同濃度分別精密加入對照品溶液1.0，2.0和3.0 mL，平行加入3份，加甲醇適量，70 ℃水浴加熱，時時振搖，至樣品完全溶解，加甲醇稀釋至刻度，放冷，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后用0.22 μm微孔濾膜迅速濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按上述色譜條件下進行測定。

1.2.2 抑菌效力測試方法

① 細菌培養物的制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌接種在TSA培養基斜面上，將其置于的培養箱中，培養箱溫度設置到35 ℃，24 h后,用適量無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫各培養基表面的培養物，采用比濁法制成每mL含菌數約為108cfu的菌懸液。

② 真菌培養物的制備：白色念珠菌接種到SDA斜面上，將其置于的培養箱中，培養箱溫度設置到25 ℃，48 h后,用適量無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫培養基表面的培養物，制備成濃度為108cfu/mL的菌懸液。

黑曲霉采用SDA，同樣置溫度設為25 ℃培養箱中，不同白色念珠菌的是培養時間為7 d。孢子懸液的制備方法如下：取新鮮培養物，使用0.05%(mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為洗脫液，并用無菌試管收集孢子懸液，用適量上述洗脫液稀釋并制成每1 mL含孢子數108cfu的孢子懸液。

1.2.3 微生物計數方法適用性試驗：因為復方醋酸地塞米松乳膏對真菌，特別是白色念珠菌有抑制作用。因此，細菌計數試驗時可采用常規法，真菌的抑制作用可以用薄膜過濾法來消除。

① 供試液的制備：取樣品約10 g，置錐形瓶中，加無菌十四烷酸異丙酯30 mL，充分振搖使溶解，加入預先在40 ℃保溫的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)至100 mL，振搖5-10 min，萃取，靜置，油水分層后，取水層作為1:10的供試液。

② 細菌計數方法適用性試驗：取供試液1 mL和試驗菌(<100 cfu)的，分別注入同一平皿中，立即傾注TSA，按常規法測定其菌落數。

③ 真菌計數方法適用性試驗：取“1.2.2項下②”項下菌懸液(<100 cfu)，加1mL供試液作為試驗菌液, 用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)至100 mL，通過薄膜過濾器后，用沖洗液沖洗2次，每次200 mL，轉膜貼至平板上,測定菌數。

1.2.4 抑菌效力試驗

① 供試液制備：供試品的制備方法同“1.2.3”項下“①”。4個廠家共5批樣品，平行制備5份。

② 供試品接種：取上述供試液，置于無菌試管中，直接接種100 μL 的“2.2. 1”項下的制備好的菌懸液，最終含菌量為105～106cfu/mL，密封搖勻，置于培養箱(25 ℃)中培養待用。

③ 存活菌數測定：根據《中國藥典》抑菌效力判定標準規定的間隔時間，于供試品接種的2、7、14、28 d，分別取“1.2.4”項“①”中接種的各供試品1 mL，稀釋成適當的稀釋級，分別采用上文驗證后的微生物計數方法進行菌落計數。

2 結果

2.1 線性關系考察 得回歸方程Y=4216.2X+0.3208，相關系數r=0.9997，結果顯示對照品溶液在6.63～132.6 μg/mL線性范圍內與峰面積呈良好線性。

2.2 精密度考察 測得羥苯乙酯峰面積的RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性考察 測得羥苯乙酯峰面積的RSD為1.1%，表明在12 h內供試品溶液穩定性良好。

2.4 重復性考察 算得羥苯乙酯峰面積的RSD為1.4%，表明方法重現性良好。

2.5 回收率試驗 平均回收率為99.2%，RSD為1.6%，結果表明方法準確度良好。

2.6 樣品含量測定 文中對市售的6個批號的樣品按照上述色譜條件進行羥苯乙酯含量的測定，含量在0.04%～0.11%，不同廠家的羥苯乙酯含量相差較大，同一廠家不同批號的樣品含量也不同。見表1。

表1 羥苯乙酯的含量測定結果(%)

2.7 微生物計數方法適用性試驗結果 驗證結果表明，細菌計數試驗時采用常規法，真菌的計數試驗采用薄膜過濾法，回收率高于70%，符合規定。見表2。

表2 計數方法實驗結果

2.8 抑菌效力試驗結果 通過查閱皮膚給藥制劑抑菌效力判斷標準，其中要求細菌的2 d減少的lg值不小于2,7 d減少的lg值不小于3,28 d試驗菌增加數量不超過0.5 lg；真菌的14 d減少的lg值不小于2，28 d試驗菌增加數量不超過0.5 lg。由表4 結果可知，5個批次的樣品抑制真菌的能力都符合標準的規定，14 d后基本上無菌落生長，28 d后也無復生長的現象。但樣品中不同濃度的羥苯乙酯對細菌的抑制能力從表3中來看，2號作為低濃度抑菌劑的代表，其抑菌效力無法滿足實際需要，達不到A類產品的規定要求， 而5號樣品濃度略高，基本能符合抑菌力檢查的規定。另外3個批次的樣品抑菌效力大大超過了規定的lg值，提示有過量添加的可能性。5批次樣品的測定結果見表3、4。

表3 樣品抑菌效力測定結果(細菌)

表4 樣品抑菌效力測定結果(真菌)

3 討論

參考相關文獻[5-8]文中先后比較了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相，發現乙腈-水作為流動相時峰形較寬，調整使用了不同比例的甲醇-水作為流動相，結果分離度偏小，故采取加入磷酸鹽的方法。試驗證明甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(35:65)作為流動相對主成分和羥苯乙酯有良好的分離效果。

文中試驗結果發現同一廠家不同批次的抑菌劑添加量差別較大，有的相差一倍以上，存在隨意性。同時也發現不同廠家抑菌劑添加量不同，存在過度使用的問題。分析其原因可能生產廠家對合理使用抑菌劑主觀重視程度不夠，認為只要能達到效果，量多量少差別不大。但本文試驗表明，抑菌劑的添加量不足，則會達不到對細菌的抑菌效果，如添加量過大雖然可以保證抑菌效力，但其潛在的毒性也需引起重視[9-12]。故藥企需要按照新版藥典(通則1121)的要求，采用含不同種類不同濃度抑菌劑的樣品多次試驗，甚至可以采用復方組成，找到最佳配比[13-15]，保證用藥安全。

抑菌劑作為軟膏處方中必要的組成部分應該引起藥企和監管部門的重視，《中國藥典》2015 年版已經將抑菌效力由原來的指導原則[16]升級為抑菌效力檢查法(通則1121)的要求。但國內大多數的軟膏劑的說明書僅標注抑菌劑名稱，對其含量諱莫如深。除了部分滴眼液外，藥品質量標準對抑菌劑的檢驗也存在缺失現象。建議在日常監管和國家評價性抽驗中，積極探索軟膏劑抑菌劑的檢驗方法，深入研究，了解抑菌劑的使用現狀，為制訂更為科學嚴格的藥品質量標準夯實基礎。

[1] 謝桂群.復方醋酸地塞米松乳膏治療PICC 相關濕疹的療效觀察[J].現代醫藥衛生，2013，29(4)：611-612.

[2] 高瑩，甄甄，張勤，等. 0.025%醋酸地塞米松乳膏聯合膚樂霜治療嬰幼兒濕疹、特應性皮炎的隨機對照研究[J].北京醫學，2015，37(2)：145-147.

[3] 邱艷紅. 糖皮質激素類藥物的臨床使用情況分析[J].海峽藥學，2015，27(4)：220-221.

[4] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(四部)[S].2015年版.北京：化學工業出版社：23-24.

[5] 林琪珊，洪淑華，余良鐘. 復方醋酸地塞米松乳膏有關物質的測定及其雜質的確定[J].中國藥房，2013，24(9)：843-845.

[6] 簡炎林,鄒國芳. 醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量測定[J].中國藥房，2009，20(13)：1016-1017.

[7] 焦旭雯，張雷，陳華. HPLC 法測定麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的含量[J].中國生化藥物雜志，2015，35(11)：169-171.

[8] 孫蒙，閆小玉，畢開順，等. HPLC 測定 11 種中藥口服液中 6 種防腐劑的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(3)：76-79.

[9] 李中東，張云軒，郭燕萍，等.羥苯酯類防腐劑的不良反應[J].中國藥物警戒，2012，9(5)：303-305.

[10] 林忠洋，馬萬里，齊跡，等.對羥基苯甲酸酯類防腐劑的人體暴露[J].化學進展，2015，27(5)：614-622.

[11] 成海平. 藥品研發中防腐劑的應用及質控[J].中國新藥雜志，2005， 14(8) : 954 -956.

[12] 吳朝陽.淺談注射劑中抑菌劑引起的不良反應[J].中國醫學工程，2012，20(3) : 180-181.

[13] 傅蓉， 王超， 趙曉冬，等. 左氧氟沙星滴眼液抑菌劑劑量篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2013，33(12)：2056-2060.

[14] 劉艷，牟衛偉，王麗英，等. 硝酸毛果蕓香堿滴眼液抑菌劑濃度篩選與抑菌效力研究[J].中國藥事，2014，28(12)：1313-1317.

[15] 丁勃，徐曉潔，謝元超.氫溴酸加蘭他敏口服液添加抑菌劑篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2011，31(12)：2312-2317.

[16] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京：化學工業出版社，2010：附錄215-216.

(編校：王冬梅)

Determination of the antibacterial agent content of compound dexamethasone acetate cream and its antibacterial effect evaluation

LIN LinΔ

(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital Harbin Medical University, Harbin 150000, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method to determine the antiseptics in compound dexamethasone acetate cream and evaluate the usage rationality of antimicrobial preservatives. MethodsThe content of ethyl hydroxybenzoate was calculated by external standard with HPLC.The effectiveness of antimicrobial preservatives was measured according to the preservative effectiveness test in ChP(2015edition) by inoculating 5 kinds of test microorganisms includingPseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,CandidaalbicansandAspergillusniger. ResultsThe linear ranges of ethyl hydroxybenzoate was 6.63-132.6 μg/mL(r=0.999 7).The average recoveries was 99.2%.The samples from different batche had different antimicrobial effectiveness due to the content of ethyl hydroxybenzoate. ConclusionThe described method can be used in the determination of the preservatives of ethyl hydroxybenzoate in compound dexamethasone acetate cream. At present the use of antibacterial agent is arbitrary, it is necessary to strengthen research and supervision.

compound dexamethasone acetate cream;ethyl hydroxybenzoate;content determination;antimicrobial effectiveness

林琳，通信作者，女，碩士，住院醫師，研究方向：心血管病用藥，E-mail: 2198176768@qq.com。

R927.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.59