通用型植物GFP標簽蛋白表達載體的構建和蛋白質的細胞內定位研究

孟祥潮，劉國富，劉營，鮑岳，曹雪松Δ

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

通用型植物GFP標簽蛋白表達載體的構建和蛋白質的細胞內定位研究

孟祥潮1，劉國富1，劉營2，鮑岳2，曹雪松1Δ

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

目的 構建通用型植物GFP標簽蛋白表達載體，研究蛋白質的細胞內定位對蛋白質組學和代謝組學等研究的意義。方法 構建2種GFP標簽蛋白質表達載體，分別在GFP的N和C端預留克隆位點，以克隆目的基因。利用該基因克隆載體，分別克隆內切酶FokI的切割結構域與MS2噬菌體外殼蛋白MCP的串聯蛋白(FokI:MCP:FokI，FMF)至GFP的N和C端，得到FMF與GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP，其中FMF的N端帶有細胞核定位信號。利用農桿菌介導植物瞬時表達侵染本氏煙草和洋蔥表皮細胞，觀察GFP熒光表達情況。結果 成功構建了2種融合了目的基因和GFP的表達載體pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP。激光共聚焦結果顯示侵染了只含GFP載體的農桿菌的煙草細胞，可在細胞核和細胞質中檢測到GFP的綠色熒光，而侵染了含核定位信號FMF：GFP和GFP：FMF 2種融合蛋白載體的農桿菌的煙草細胞，只在細胞核中觀察到綠色熒光。結論 該載體系統可運用于研究蛋白質在植物細胞中的亞細胞定位，具有克隆簡單、高效和通用性的特點。

亞細胞定位；植物表達載體；瞬時表達

利用綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)融合目的蛋白是目前研究蛋白質亞細胞定位、蛋白質動態變化和表達量等的有效方法。該方法不需要繁瑣的樣品制備過程，不受非特異性標記的影響，可在光學顯微鏡下直接進行觀察[1]，是監測活細胞和組織內基因表達和蛋白質定位的理想標記，已被廣泛用作報告基因，是進行體內蛋白質研究的重要實驗方法[2-6]。GFP在藍光激發下發出綠色熒光，可以與目標蛋白融合，作為熒光標記分子，特異性地觀察蛋白質的亞細胞定位[7]。GFP能在蛋白質的N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，而且靈敏度高、對活細胞無毒害作用。GFP 在光照下是穩定的，各種光照都不會引起其變性，即使與其他蛋白質融合后，也能利用熒光顯微鏡很方便地檢測，所以應用廣泛[8]。GFP蛋白經激光掃描共聚焦顯微鏡激光照射后，可產生一種綠色熒光，從而對蛋白質進行精確定位。本實驗旨在構建pER35GFP.1和pER35GFP.2系列表達載體，并將FMF融合蛋白構建入載體，對煙草葉片進行農桿菌侵染轉化，再通過觀察葉片中GFP的表達得到研究蛋白的定位情況。FMF融合蛋白中的FokI核酸酶和MCP(MS2噬菌體衣殼蛋白)[9]在天然狀態下是不進入細胞核的，在融合蛋白FMF兩端加上核定位信號可觀察FMF融合蛋白進入細胞核情況，從而驗證本系統的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗植物、質粒和菌株:本式煙草(Nicotiana benthamiana)、質粒pER350和S18GFP.1及18M-1(含有FMF蛋白基因并且兩端帶有核定位信號)、農桿菌GV3101、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑和引物:膠回收試劑盒、2×Taq PCR StarMix購自北京康潤誠業生物科技有限公司。Probest DNA polymerase、T4 DNA連接酶和卡那霉素(Kan)等試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。NCOI、BglII、speI等限制性內切酶購自New England Biolabs(NEB)或TaKaRa公司。普通生化試劑為國產分析純。

1.1.3 儀器：FTC-200 PCR儀(FedBio公司);Tanon 3500R 凝膠成像系統(天能公司)；OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)；Olympus FV1200雙掃描激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 定位表達載體的構建:載體pER350先用NcoI酶切，柱純化，再用SpeI酶切，回收8231bp片段，命名為pER350-1(3’、5’端分別為NcoI、SpeI)。

以S18GFP.1為模板擴增GFP基因，PCR產物GFP1(3’、5’端分別為NcoI、BglII位點)大小為733bp，將GFP1，adaptor ADGF1(adaptor ADGF1F、adaptor ADGF1R經過退火配對形成的DNA雙鏈，3’、5’端分別為BglII、SpeI位點)及 pER350-1(3’、5’端分別為NcoI、SpeI位點)載體在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜。連接后的產物進行轉化實驗，構建載體命名為pER35GFP.1。

以S18GFP.1為模板擴增GFP基因，PCR產物GFP2 (3’、5’端分別為BglII、SpeI位點) 大小為758bp，將GFP2，adaptor ADGF2(adaptor ADGF2F、adaptor ADGF2R經過退火配對形成的DNA雙鏈，3’、5’端分別為NcoI、BglII位點)及 pER350-1(3’、5’端分別為NcoI、SpeI位點)載體在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜。連接后的產物進行轉化實驗，構建載體命名為pER35GFP.2。

轉化子經菌落PCR鑒定后挑取陽性克隆送華大基因公司測序，并用DNAMAN軟件對測序結果進行分析。adaptor ADGF1 和adaptor ADGF2退火程序如下：94 ℃ 1min, 85 ℃ 1min, 75 ℃ 1 min, 65 ℃ 2min，55 ℃ 2min，45 ℃ 2min，25 ℃ 2min，3個循環。

1.2.2 融合FMF定位表達載體的構建:BglII酶切18M-1載體，膠回收 1708bp的FMF片段。載體pER35GFP.1、pER35GFP.2先用BglII酶切，柱純化，回收載體片段，將FMF片段分別與載體pER35GFP.1、pER35GFP.2在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜。連接后的產物進行轉化實驗，將轉化子進行菌落PCR鑒定，得到融合FMF的定位表達載體pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP。FMF基因片段大小應為1708 bp。PCR反應體系為：模板菌液1 μL，2×Taq PCR StarMix 25 μL，引物NLSMFF(20 μmol/L)1 μL， 引物NLSMFR(20 μmol/L)1 μL，超純水22 μL。反應程序如下： 94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃100 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選陽性克隆。

1.2.3 質粒提取及鑒定:37 ℃恒溫搖床搖菌10 h后按照《現代分子生物學實驗技術》[10]中堿裂解法提取質粒。隨后各取1 μL提好的質粒，與1 μL 6×核酸上樣緩沖液及4 μL超純水混合，進行瓊脂糖凝膠電泳。當指示帶位于瓊脂糖凝膠的3/4處時，使用凝膠成像系統進行觀察和拍照。

煙農主要通過參加煙草公司舉辦的培訓及宣傳來了解農藥相關知識。調查統計有94.0%的煙農都參加過煙草公司組織的煙葉質量安全培訓。在培訓中，煙葉技術員主要對農藥種類、安全間隔期、科學用藥、綠色防控等方面進行了培訓。煙農獲得農藥知識的另一渠道則來自銷售人員的講解及其與親朋好友、鄰居的交流。

1.2.4 農桿菌的轉化與篩選:農桿菌的轉化及所用試劑參考楊紀君等[10]方法。取表達載體pER35GFP.1、pER35GFP.2、pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP各1 μL分別加入到60 μL農桿菌感受態GV3101中，混合均勻后置于冰上3～5 min，進行電擊轉化。加入600 μL LB培養基(50 mg/L Kan，50 mg/Rif)，吸取到EP管中于28 ℃培養箱中培養2 h，取50 μL涂布于含有相應抗生素(50 mg/L Kan，50 mg/Rif)的平板上，于28 ℃培養箱中倒置培養30～40 h，對長出的菌落進行菌落PCR鑒定。

1.2.5 農桿菌侵染煙草葉片細胞和洋蔥表皮細胞的瞬時表達:將 pER35GFP.1、pER35GFP.2、pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP，轉化到GV3101農桿菌細胞中。將含表達載體的農桿菌轉接于液體培養基，培養至對數生長期，離心收集菌體，加入浸潤緩沖液[11]，重懸至OD600值約為 0.1～1.5，室溫靜置2～3 h后用于浸潤。

采用農桿菌滲入法感染煙草葉片。用針頭在植株葉片上扎2個孔，用無針頭的針管注射葉片，依靠壓力將菌液注入葉片的葉脈之間。通過農桿菌注射，大量的 T-DNA 轉移到植物體內細胞核中，最后進行瞬時表達[12]。28 ℃條件下培養3 d，光照周期為 16 h光照/8 h黑暗。

無菌條件下取洋蔥的鱗莖，將其切成若干個1 cm2的小塊，用鑷子剝取洋蔥的表皮細胞，無菌水浸泡、濾紙吸干表面液體，平鋪在1/2 MS固體培養基上。28 ℃暗培養24 h后，將預培養后的洋蔥表皮在1.2.3獲得的農桿菌液中浸泡 30 min，濾紙吸干表面的菌液，轉入1/2 MS固體培養基中 25 ℃培養2 d，光照周期為16 h光照/8 h黑暗[13]。

1.2.6 GFP綠色熒光的觀察:煙草葉片培養3 d后采集葉片，置于熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡(奧林巴斯FV1200)下，激發波長為480 nm，觀察GFP的表達情況及亞細胞定位情況。

2 結果

2.1 定位表達載體的構建 對轉化子pER35GFP.1和 pER35GFP.2(構建圖譜見圖1A、1B)進行菌落PCR，產物進行1%凝膠電泳，結果見圖1C：分別在733 bp和758 bp處出現特異性擴增的條帶，且符合目的片段大小。使用DNAMAN軟件分析DNA測序結果，顯示回收獲得的733 bp、758 bp片段，與質粒S18GFP.1序列上GFP的序列一致性達100%。表明目的片段GFP均已成功插入載體。

圖1 表達載體pER35GFP的構建A，B：植物表達載體pER35GFP.1和pER35GFP.2；C：重組質粒經 PCR鑒定的電泳結果。M：D2000 marker，A1-A3：重組質粒pER35GFP.1經PCR得到的733bp片段；B1：重組質粒pER35GFP.2經PCR得到的758bp片段；0：空載體Fig.1 Construction of expression vector pER35GFPA, B:Plant expression vector of pER35GFP.1 and pER35GFP.2 respectively; C: Agarose gel electrophoresis results of PCR for pER35GFP.1, pER35GFP.2. M:D2000 Marker;A1-A3: 733bp PCR fragments of amplified DNA from pER35GFP.1, B1:758bp PCR fragments of amplified DNA from pER35GFP. 1;0:Empty vector

2.2 融合FMF定位表達載體的構建 對轉化子pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP進行菌落PCR，產物進行1%凝膠電泳檢測，結果見圖2。在1708 bp處有明顯的特異性擴增的條帶，且符合目的片段大小。表明目的片段成功插入到載體中。

圖2 融合FMF定位表達載體鑒定M:D2000 marker；B:雙蒸水；B0：空載體；B1-B3：pER35GFP-FMF轉化子；B4-B6：pER35FMF-GFP轉化子Fig.2 Bacterium liquid PCR results of fusion FMF localization expression vectorM:D2000 marker;B:ddH2O;B0:Empty vector;B1-B3: pER35GFP-FMF; B4-B6: pER35FMF-GFP

2.3 農桿菌侵染煙草葉片細胞和洋蔥表皮細胞瞬時表達GFP結果 采集注射農桿菌pER35GFP.1、pER35GFP.2和pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP后瞬時表達3d的煙草葉片和洋蔥表皮，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(見圖3A)。可在注射了農桿菌表達載體pER35GFP.1、pER35GFP.2的煙草葉片和洋蔥表皮的細胞核與細胞膜周邊觀測到GFP熒光，而注射了農桿菌融合FMF定位表達載體的pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP煙草葉片和洋蔥表皮，只在細胞核中觀測到GFP熒光。表明在核定位信號的作用下，融合GFP定位的FMF蛋白已進入細胞核。只注射農桿菌GV3101的細胞沒有觀測到熒光。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示(見圖3B)，侵染含有表達載體農桿菌pER35GFP.1、pER35GFP.2的洋蔥表皮細胞，在細胞質和細胞核中均能觀測到綠色熒光，而在注射農桿菌融合FMF定位表達載體pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP的洋蔥表皮細胞中，細胞壁無綠色熒光，僅細胞核中能觀測到綠色熒光。只注射農桿菌GV3101的洋蔥細胞沒有觀測到綠色熒光。

圖3 煙草葉片細胞和洋蔥表皮細胞的瞬時表達GFP結果A：熒光顯微鏡下結果；B：激光共聚焦顯微鏡下結果Fig.3 Results of transient expressing GFP in the leaves of Nicotiana benthamiana and onion epidermal cells A:Results under Fluorescence microscope;B:Results under laser confocal scanning microscopy

3 討論

蛋白質科學研究將帶動生物、醫藥、農業等相關產業的發展，由此催生的一系列新技術將引領未來生物經濟。生命科學正邁入后基因組(或功能基因組學)時代，功能基因組學研究的重心將轉向基因功能的鑒定，即由測定基因的DNA序列、解釋生命的所有遺傳信息轉移到從分子及整體水平對生物學功能的研究上，在分子層面探索人類健康和疾病的奧秘。蛋白質基礎研究將在分子、細胞、生命體的各個層面來揭示生命現象的本質[14]。目前蛋白質的亞細胞定位以及蛋白質濃度含量的測定已廣泛運用于多種生物，但簡單、高效和通用型的標簽表達載體還比較缺乏。構建標簽表達載體可極大地方便基因克隆和蛋白質定位等研究，目前已有各種標簽短肽的檢測試劑盒，因此開發通用型的標簽載體，不僅可以定量檢測目標蛋白表達，通過與GFP熒光進行對照觀察，還能使蛋白質定量更為精確和直觀。本文構建了通用型植物GFP標簽蛋白表達載體，該載體可以運用于研究蛋白質在植物細胞中的亞細胞定位；同時可以通過對GFP蛋白的定量而得到研究的目的蛋白的含量。該技術具有以下幾個優點：

① 設計操作相對簡便。傳統方法在研究蛋白質定位時，需要通過DNA重組技術得到目的基因與標記基因重組后的表達產物，在構建多片段DNA插入的載體時，每插入一個片段就需要一次連接、轉化及陽性克隆鑒定，操作步驟繁瑣，通常要構建多個中間載體，要經多次連接、轉化，增加了重組體鑒定時的工作量，費時又費力。而使用通用型植物GFP標簽蛋白表達載體只需要針對目的基因設計一對引物并且引物兩端設計留有BglII位點，即可通過一步連接而構建好融合GFP標簽蛋白的表達載體。之前的研究表明，不同的目的蛋白其核定位信息可能在N端也可能在C端，甚至兩端都有[15]，因此如果僅將熒光蛋白融合在目的基因一端，很可能導致信號肽無法被識別[16]。本載體系統在研究目的蛋白N端和C端分別融合GFP基因，構建了2個亞細胞定位載體，使用者可以根據研究目的蛋白的具體情況進行選擇。

② 標記基因容易觀察、成本低廉。通用型植物GFP標簽蛋白表達載體使用GFP作為標記基因，在熒光顯微鏡下即可觀察，能夠清楚的觀察到被研究蛋白的位置情況，相較于其他定位方法，如免疫膠體金標記、免疫熒光等，使用成本低廉。

③ 能夠定量研究蛋白質的表達量。目前GFP綠色熒光蛋白定量試劑盒已廣泛應用。可以通過對GFP表達量的測定而得到被研究蛋白的表達情況。

本文利用通用型植物GFP標簽蛋白表達載體研究蛋白質的細胞內定位。實驗設計簡便，簡化了大量的實驗步驟。實驗材料可以通過熒光顯微鏡直接觀察，成本低廉具有很高的性價比。并且能夠通過GFP綠色熒光蛋白定量試劑盒來定量研究蛋白的表達。本套載體的構建為研究植物中蛋白質亞細胞定位及定量提供了一個很好的基因克隆工具。

[1] Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G, et al.Green fluoreacent protein as a maker for green expression[J].Science,1994,263:802-805.

[2] Trutnyeva K,Ruggenthaler P.Movement profiles:a tool for quantitative analysis of cell-to-cell movement of plant viral move ment proteins[J].Methods Mol Biol,2008,451:317-329.

[3] Michaelson D,Abidi W.Rac1 accumulates in the nucleus during the G2 phase of the cell cycle and promotes cell division[J].Cell Biol, 2008,181(3):485-496.

[4] Calderon F,Kim H Y.Detection of intracellular phosphatidylserine in living cells[J].Neurochem, 2008,104(5):1271-1279.

[5] Wan LC, Yasuo NA.Engineered GFP as a vital reporter in plants[J].Current Biology,1996,6(3):325-330.

[6] Jen S, Seongbin H.Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells[J].The Plant Joural,1995,B(5):777-784.

[7] Bisicchia P, Botella E, Kevin M.Suite of novel vectors for ectopic insertion of GFP, CFP and IYFP transcriptional fusions in singlecopy at the amyE and bglS loci in Bacillus subtilis[J]. Plasmid,2010,64(3):143-149.

[8] Sullivan KF,Kay SA.Green fluorescent proteins[J].Methods in Cell Biology,1998,58:386.

[9] van Meerten D,Olsthoorn RC, van Duin J, et al.Peptide display on live MS2 phage: restrictions at the RNA genomelevel[J].J Gen Virol,2001,82:1797-1805.

[10] 盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 北京：高等教育出版社, 1993：108 -112.

[11] 楊紀君，劉國富，申永梅，等.大麥黃矮病毒運動蛋白核定位信號對PVX病毒運動的影響[J].病毒學報，2012(01)：35-44.

[12] Liu CW,Chin- Voinnet O, Pinto YM, et al.Suppression of gene silencing: a general strategy used in diverse DNA and RNA viruses of plants[J].Plant Biology,1999,96(24):14147-14152.

[13] Rossi L,Escudero J,Hohn B, et al. Efficient and sensitive assay for T-DNA-dependent transient gene expression[J].Plant Mol Biol Report,1993,11(3):220-229.

[14] 劉肖飛，梁衛紅.根癌農桿菌介導的GFP在洋蔥表皮細胞定位研究[J].河南師范大學學報(自然科學版)，2009(01)：123-125,150.

[15] 劉俊彥. 蛋白質多維色譜分離與熒光標記定量新方法研究[D].上海：復旦大學，2012.

[16] Wang P, Wu YL, Ge X, et al.Subcellular localization of -arrestins is determined by their intact N domain and the nuclear export signal at the C terminus[J].J Biol Chem,2003,278:11648-1165.

[17] Simpson JC, Wellenreuther R, Poustka A, et al.Systematic subcellular localization of novel proteins identified by large-scale cDNA sequencing[J].EMBO Rep,2000,1(3):287-299.

(編校：吳茜)

Universal expression vector with GFP label protein was used to study protein localization in plant cell

MENG Xiang-chao1, LIU Guo-fu1, LIU Ying2, BAO Yue2, CAO Xue-song1Δ

(College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the application of universal expression vector with GFP label protein, study the meaning of protein localization in plant cell in the field of proteomics and metabolomics.MethodsTwo sets of GFP tagged protein expression plasmids,in which the N and C terminals of GFP fragments contained multiple cloning sites for inserting genes of interesting were constructed in this study. By utilizing these constructs, we cloned endonuclease FokI cleavage domain fused with MS2 bacteriophage coat protein (MCP) forming fusion protein FokI:MCP:FokI(FMF), in which the cellular nuclear localization signals(NLS) were linked to N and C terminals of GFP respectively. The expression of cloned genes are expected to create fusion proteins of GFP:FMF and FMF:GFP respectively. The resulting constructs were transformed into agro-bacterium and transiently expressed both in the cells of Nicotiana benthamiana and onion leaf epidermic cells via agrobactereal infiltration.ResultsTwo expression vector with GFP and target protein were constructed successfully. The observation under confocal microscope showed that the GFP protein localizes both in nuclear and cytoplasm and NLS:GFP:FMF and FMF:GFP:NLS only in the nuclear.ConclusionThese constructs can be utilized for studying protein subcellular localization in plant cells, which is easy to use, high efficiency and versatile.

subcellular localization; plant expression vector; transient expression

國家自然科學基金(31370387)

孟祥潮，男，碩士，研究方向：植物分子與病毒，E-mail: 745851140@qq.com；曹雪松，通信作者，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物學，E-mail:caoxuesong@lcu.edu.cn。

Q944

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.08