ATO增強As2S2抗小鼠Lewis肺癌效應的初步研究

顧亞琴，楊召聰，錢知知，張良Δ

(1.南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023；2.江蘇省藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇 南京 210023)

ATO增強As2S2抗小鼠Lewis肺癌效應的初步研究

顧亞琴1，楊召聰2，錢知知2，張良1Δ

(1.南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023；2.江蘇省藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇 南京 210023)

目的 觀察三氧化二砷(ATO)對硫化砷(As2S2)抗腫瘤效應的影響。方法 選取4、2、0.5μM ATO，分別與不同濃度As2S2合用，MTT法觀察不同濃度ATO對Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用；以荷Lewis肺癌小鼠為模型，隨機分為模型組，順鉑組[5 mg/(kg·d)，ip]，ATO組[1 mg/(kg·d)，ip]，As2S2高、中、低劑量組[8、2、0.4 g/(kg·d)，ig]，As2S2高、中、低劑量+ATO組，連續給藥2周。觀察小鼠體質量、腫瘤抑制率、胸腺及脾指數、脾組織CD4+/CD8+T細胞比值；RT-PCR法檢測脾組織中穿孔素(Perforin)、顆粒酶B(Granzyme B)mRNA含量。結果 4μM ATO可顯著增強As2S2對Lewis細胞的增殖抑制作用(P<0.05)；As2S2中劑量+ATO組的抑瘤率顯著高于As2S2單獨給藥組(P<0.05);與As2S2單獨給藥組相比，As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中CD8+T細胞數及CD4+/CD8+比值均顯著增高(P<0.05); As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中Granzyme B mRNA表達顯著高于模型組(P<0.05)。結論 ATO可顯著增強As2S2對Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用，可能是通過增強機體免疫反應發揮增效作用。

硫化砷；三氧化二砷；抗腫瘤增效；Lewis肺癌;T細胞免疫

雄黃為硫化物類礦物藥[1-2]，主要成分為硫化砷(As2S2)，同時含有少量的三氧化二砷(ATO)。入藥始載于《神農本草經》，在我國臨床應用已有兩千多年歷史。雄黃在治療多種腫瘤中顯示出獨特的療效[3]，并且隨著對其抗腫瘤機制的深入研究，發現雄黃具有發展為新型抗癌藥物的潛力，而如何使其進一步應用于臨床成為研究者們非常關注的問題。其所含少量的ATO為可溶性成分，毒性較大，但同時抗腫瘤作用明確，究竟應將ATO作為有害物質完全去除，還是應制定限量標準予以保留，目前尚無定論。研究報道[4-5]，低劑量ATO能在不影響放、化療腫瘤治療效果的同時降低其對正常組織的毒副作用。因此，本實驗以低劑量ATO為切入點，初步觀察ATO對雄黃抗腫瘤藥效的影響，為進一步認識傳統中藥雄黃提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物：Lewis肺癌細胞由南京中醫藥大學陸茵教授饋贈；C57BL/6雄性小鼠，SPF級，6～8周齡，18～22 g,80只，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供[生產許可證號：SCXK(滬)2013-0006]。

1.1.2 藥品：As2S2由南京中醫藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心李偉東老師提供并鑒定，As2S2含量>98%，符合藥典規定；注射用ATO(北京雙鷺藥業股份有限公司，批號：20131002)；注射用順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司，批號：2WA2A1402009B)。

1.1.3 試劑：DMEM培養(HyClone，批號：NZM1303)；胰蛋白酶(Gibco，批號：1627654)；胎牛血清(Foundation TM，A46E00F)；二甲基亞砜(Sigma)；PBS(博士德生物工程有限公司，10B16B30)；四甲基偶氮唑藍干粉(MTT，Sigma)；Anti-Mouse CD8 FITC、Anti-Mouse CD4 PE抗體均購自美國eBioscience公司。

1.1.4 儀器：Synergy HT型酶標儀(Bio-Tek,USA)；BH2型生物顯微鏡(日本Olympus)；Accuri C6流式細胞儀(BD,USA)；游標卡尺(上海量具刃具有限公司)；凝膠成像系統(美國BIO-Rad公司)；精密分析天平(Sartorius公司)；FA1104N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；熒光定量PCR(羅氏公司 Lishtcycler96)；TSZ5-WS型離心機(上海盧湘儀器有限公司)；Allegra X-15R冷凍離心機(Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：Lewis肺癌細胞培養于DMEM完全培養基(含10%的胎牛血清)，37 ℃、5%CO2培養箱中，細胞呈貼壁狀態，每1～2天以0.25%的胰蛋白酶消化后，傳代，細胞貼壁3～4代，取指數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測ATO對Lewis肺癌細胞增殖影響：將5×104個/mL的對數生長期Lewis細胞接種于96孔板，每孔200 μL,次日分為空白對照孔，終濃度為(0，0.1,0.5,1,2,4,8,10) μM的ATO給藥組，每組設6個平行孔。繼續培養24 h后，MTT法檢測(自動酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值)，計算細胞存活率及增殖抑制率，初步摸索并確定對Lewis細胞無影響的ATO劑量上限值。細胞存活率=給藥組A值/空白對照組A值×100%。

1.2.3 MTT法觀察ATO對As2S2的體外抗腫瘤效應影響：將5×104個/mL的對數生長期Lewis細胞接種于96孔板，每孔200 μL,次日分為空白對照孔，終濃度為(2,4,8,16,32,64,128)μg/mL的As2S2給藥組以及各濃度As2S2分別與ATO(0.5,2,4)μM聯合給藥組，每組設6個平行孔。繼續培養24 h后，MTT法檢測(自動酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值)。增殖抑制率=(1-給藥組A值/空白對照組A值)×100%。

1.2.4 模型小鼠的建立、分組及給藥:C57BL/6小鼠，80只，除正常對照組，其余每鼠接種0.2 mL Lewis肺癌細胞懸液(106/mL)于右腋窩皮下24 h后[6-7]，隨機分為模型組、DDP組(陽性藥)、ATO組、As2S2(高、中、低)組、As2S2高、中、低劑量與ATO聯合給藥組，每組8只，順鉑組腹腔注射5 mg/(kg·d)； ATO組腹腔注射1 mg/(kg·d); As2S2給藥組按照(8、2、0.4)g/(kg·d)灌胃給藥；As2S2與ATO聯合給藥組同時灌胃As2S2[8、2、0.4 g/(kg·d)]及腹腔注射ATO[1 mg/(kg·d)]，正常對照組和模型組給予等體積0.9%NaCl，皆連續給藥2周。

1.2.5 各給藥組對荷Lewis小鼠體質量、瘤體及免疫器官的影響：給藥期間，隔天記錄小鼠體質量；末次給藥1 h后，處死動物，剝取瘤塊，脾臟，胸腺，分別稱重，計算抑瘤率(IR)、脾指數、胸腺指數。抑瘤率(%)=[1-實驗組瘤重(g)/模型組平均瘤重(g)]×100%；臟器指數(mg/g)=臟器重量/動物體質量×1000。

1.2.6 T細胞檢測：每組隨機取3只小鼠，處死置于75%乙醇中浸泡3～5 min；無菌條件下制備小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液；根據細胞計數結果染抗體：FITC-CD8，PE-CD4，4 ℃避光30 min；每孔加200 μL staining buffer洗，4 ℃、1500 r/min、離心 5 min, 吸去上清，重復2次；孔里最終剩余的細胞轉移至流式管，以500 μL 1%的多聚甲醛固定，放在暗處，2 ℃～8 ℃在24 h內檢測。

1.2.7 小鼠脾臟組織中Perforin、Granzyme B mRNA含量檢測：選取模型組、ATO(0.001 g/kg)組、As2S2中劑量組(2.00 g/kg)、As2S2+ATO中劑量組(2.00 g/kg+0.001 g/kg)，每組隨機取3只小鼠脾組織，提取組織RNA，經質量鑒定后，進行逆轉錄及Real-time PCR反應。參照說明書設定PCR程序：65 ℃ 5 min變性，65 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，40個循環。反應結束儀器自動生成CT值(threshold cycles)。每個樣本設3個重復管，以2-△△Ct(Ct值代表循環閾值)表示基因的表達量。β-actin的雙向引物序列為:F:5’ GTACCACCATGTACCCAGGC3’,R:5’ AACGCAGCTCAGTAACAGTCC3’;Prf1的雙向引物序列:F:5’ TCCTATGGCACGCACTTTATC 3’,R:5’ TCAGGCAGTCTCCTACCTCATC3’;Gzmb的雙向引物序列:F:5’ TGCTCTGATTACCCATCGTCC3’,R:5’ AGCCAGTCTTTGCAGTCCTTTA3’。

2 結果

2.1 ATO對As2S2抗Lewis肺癌細胞作用的影響

2.1.1 ATO對Lewis細胞的增殖抑制作用：MTT實驗結果顯示，ATO在10 μM時，可顯著抑制Lewis細胞的增殖(P<0.05)，在低于8 μM時，Lewis細胞活性大于95%，腫瘤抑制作用較低。見表1。

表1 不同濃度ATO對Lewis細胞的增殖抑制作用

*P<0.05,**P<0.01，與空白組比較,compared with blank group

2.1.2 ATO增加As2S2對Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用：0.5、2、4 μM ATO分別與As2S2合用后，僅4 μM ATO與As2S2合用時，Lewis細胞活性顯著低于As2S2單獨用藥各劑量組(P<0.05,P<0.01)；4 μM ATO時，As2S2的IC50值(19.4±6.9 μM)顯著低于As2S2單獨給藥組(33.8±7.1)μM(P<0.05，n=3)，提示在4 μM濃度下，ATO在體外可顯著增加As2S2的抗腫瘤作用。見圖1。

2.2 ATO對As2S2抗Lewis體內移植瘤效應的影響

2.2.1 各給藥組對荷瘤小鼠體質量的影響：與模型組相比:自給藥后第8 d,DDP組小鼠體質量顯著性下降(P<0.05,P<0.01)；As2S2高劑量組小鼠自給藥后12 d起，體質量顯著下降(P<0.05)；As2S2中劑量組及As2S2高劑量+ATO聯合給藥組小鼠體質量在給藥中途即分別8～12 d、4～8 d時有顯著下降(P<0.05)，以上差異均具有統計學意義，而后期體質量均恢復至與模型組差異無統計學意義。見表2。

圖1 不同濃度As2S2與ATO聯合用藥后對Lewis細胞的增殖抑制作用*P<0.05,**P<0.01，與As2S2組比較Fig.1 The inhibition effect of different concentrations of As2S2 combined with ATO on Lewis cell proliferation (±s，n=6)*P<0.05,**P<0.01， compared with the As2S2 group

組別只數劑量(mg/kg)給藥前給藥后4d給藥后8d給藥后12d實驗末模型組8 —19.7±0.921.1±1.121.9±1.122.5±1.522.7±2.3DDP組8 5.020.3±1.121.4±1.617.9±3.1*15.8±1.3**16.4±2.1**ATO組8 1.019.1±1.021.9±1.021.4±1.322.2±1.422.0±1.3As2S2高劑量組88000.019.5±1.221.0±1.021.5±3.121.1±1.0*20.7±1.5*As2S2高劑量+ATO組88000.0+1.019.8±1.120.4±1.320.0±1.7*20.4±1.5*21.4±1.0As2S2中劑量組82000.019.7±1.319.7±0.5*19.9±0.7*21.31±1.121.3±1.5As2S2中劑量+ATO組82000.0+1.019.9±1.0720.4±1.621.0±1.721.1±5.821.3±2.8As2S2低劑量組8400.020.2±0.821.0±1.621.0±1.221.6±1.121.5±1.1As2S2低劑量+ATO組8400.0+1.019.5±1.021.2±2.021.5±1.522.1±1.322.0±1.3

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group

2.2.2 各給藥組對荷瘤小鼠肉瘤的影響:除ATO及As2S2低劑量組，其余各給藥組瘤重均低于模型組(P<0.05)；聯合給藥組中，As2S2中劑量+ATO組抑瘤率顯著高于相同劑量時As2S2單獨給藥組(P<0.05)。見表3。

表3 各組荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較Tab.3 Comparison of the tumor weight and inhibition rate in each group of mice(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

2.2.3 各給藥組對荷瘤小鼠免疫器官的影響：與模型組比較，DDP與As2S2高劑量組荷瘤小鼠脾指數均降低(P<0.05)，其余各組未見顯著差異；As2S2+ATO聯合給藥各劑量組脾臟指數均高于相同劑量下As2S2單獨給藥組；DDP組胸腺指數低于模型組(P<0.05)，其余各給藥組未見顯著差異。見表4。

表4 各給藥組對荷瘤小鼠脾臟及胸腺指數的影響Tab.4 Changes of the indexes of spleen and thymus of each group mice(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

2.2.4 各給藥組對荷瘤小鼠脾臟中CD4+/CD8+T細胞的影響:流式結果顯示，與模型組比較，DDP顯著提高荷瘤小鼠脾臟中CD8+T細胞比例；As2S2中劑量組小鼠脾組織中CD8+及CD4+T細胞表達均低于模型組；As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中CD8+及CD4+T細胞表達均顯著高于相同劑量下As2S2單獨給藥組；DDP組小鼠脾組織中CD4+/CD8+比值顯著低于模型組，而ATO+As2S2聯合給藥中劑量組中CD4+/CD8+比值顯著高于相同劑量的As2S2單獨給藥組及模型組(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 不同給藥組對荷瘤小鼠脾臟CD4+/CD8+T細胞的影響Tab.5 Effect of different administration group on mice spleen CD4+/CD8+T cells(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

圖2 不同給藥組對荷Lewis肺癌小鼠脾臟CD4+/CD8+T細胞的影響Fig.2 Effects of different administration group on mice spleen CD4+/CD8+T cells

2.2.5 不同給藥組對荷瘤小鼠脾臟中Perforin、Granzyme B mRNA表達的影響:RT-PCR結果顯示ATO+As2S2聯合給藥后小鼠脾組織中Granzyme B mRNA水平顯著增加(P<0.01)。見表6。

表6 各給藥組對荷瘤小鼠脾臟中T淋巴效應分子Perforin、Granzyme B mRNA表達的影響

**P<0.01,與模型組比較,compared with model group

3 討論

尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是腫瘤研究的重要內容。中藥雄黃(As2S2)為傳統中藥砷劑的一種，研究顯示[8-10]其具有拮抗急性早幼粒細胞白血病、多發性骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、膠質瘤等多種血液和實體腫瘤的效應。

雄黃所含的少量可溶性成分ATO抗腫瘤藥效明確。有學者通過實驗推測[11]：雄黃中As2S2既不被人體吸收，也無任何藥理活性，認為可溶性As是雄黃的活性成分；又有實驗報道[12]As2S2為難溶性組分，在體內難以吸收，應是雄黃中可溶性組分ATO在發揮藥物效應。且早在上世紀70年代，張亭棟等[13]就采用現代科學的給藥方式，以ATO為主要成分制成“癌靈”注射液，治療APL；上海血研所研究報道了ATO誘導APL細胞凋亡和部分分化的重要機制；2000年美國食品藥品監督管理局(FDA)批準ATO注射液作為復發性APL治療藥物。

雄黃所含的少量可溶性成分ATO毒性較大。高雙榮等[14]通過文獻整理分析，歸納匯總認為砷在體內主要以無機砷和有機砷等不同形態存在，且形態不同毒性不同，一般認為三價砷As(Ⅲ)毒性最大，可引起肝細胞的凋亡和灶狀壞死，在體內長期蓄積可對肝臟、腎臟、膀胱、神經系統、皮膚、胎兒發育等造成不同程度的毒性損傷；而有機砷毒性較小。顧晶晶等[15]通過比較雄黃中可溶性As與小鼠急性毒性的關系發現：雄黃的毒性存在于其可溶性部分，LD50值與可溶性As呈負相關。國內大多學者[15-17]，主張從炮制學的角度去除雄黃中所含ATO。但在炮制學的角度去除ATO的同時，雄黃抗腫瘤藥效及在治療劑量內的毒性如何變化？

本實驗首先通過MTT結果顯示：低劑量的ATO(<8 μM)處理24 h后，Lewis肺癌細胞活性大于85%，ATO對Lewis細胞活性影響較低。0.5、2、4 μM ATO分別與As2S2聯合用藥后，發現在與4 μM ATO聯合給藥時，Lewis細胞活性顯著低于As2S2單獨作用各劑量(P<0.05,P<0.01)。因此，初步認為4 μM ATO可增強As2S2對Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用。有研究報道[4-5]，低劑量的ATO(100 nM)，可通過調節正常組織發生代謝轉換，進行糖酵解，從而抵抗化療藥物的毒性作用。同時體內實驗發現[10]，低劑量的ATO(0.4 mg/kg)，在作用12個月后，并沒有產生致癌毒性。這些研究為ATO這種毒性組分的臨床應用又提供了一個新的視角。

體內抑瘤實驗結果顯示：ATO聯合給藥后，可減輕As2S2高劑量給藥時對荷瘤小鼠的體質量減輕作用；ATO聯合給藥后，可增強As2S2中劑量給藥時對荷瘤小鼠的抑瘤率(P<0.05)。免疫系統的檢測結果顯示：ATO聯合給藥后，可增加As2S2高、中、低劑量給藥時荷瘤小鼠的脾臟指數(P<0.05)，但對胸腺指數無顯著影響；ATO聯合給藥后，顯著增加As2S2低劑量給藥時小鼠脾臟CD4+/CD8+比值(P<0.05)，可見其可能是通過增強荷瘤小鼠機體免疫功能而發揮抗腫瘤增效作用。穿孔素及顆粒酶B均為細胞毒性T細胞的效應分子，穿孔素可在靶細胞細胞膜上形成不同直徑的小孔，使大分子物質流出而小分子如水分子、離子等物質進入靶細胞，誘導靶細胞滲透性壞死，而同時，顆粒酶B在穿孔素的條件下，入核，啟動細胞凋亡程序。本實驗RT-PCR結果也表明，聯合給藥后，脾組織中顆粒酶B mRNA表達顯著性增高(P<0.05)，進一步提示：聯合給藥增效的可能機制為免疫增強作用。

綜上，低劑量ATO可增加As2S2的抗Lewis肺癌作用，其抗腫瘤增效作用可能與增強荷瘤小鼠機體免疫功能相關，但兩者的聯合抗腫瘤效應及其具體機制還需進一步研究。因此，在傳統中藥雄黃的炮制過程中，可考慮限量保留ATO，但具體的劑量范圍還需要進一步的研究探討，以更好地推進中藥雄黃應用于臨床。

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(編校：王儼儼)

ATO enhanced anti-Lewis lung carcinoma effect of As2S2in mouse

GU Ya-qin1, YANG Zhao-cong2, Qian Zhi-zhi2, ZHANG Liang1Δ

(1. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China； 2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmocology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo investigate the synergistic anti-tumor effect of arsenic trioxide (ATO) on realgar(As2S2). MethodsThe inhibition effect of different concentrations of ATO on proliferation of Lewis lung carcinoma were observed by MTT method with 4,2,0.5μM ATO combined with different concentrations of As2S2. The Lewis lung carcinoma mice model was established and randomly divided into model group, cisplatin group[5 mg/(kg·d)，ip],ATO group[1 mg/(kg·d)，ip], As2S2high-, middle-, low-dose group[8,2,0.4 g/(kg·d)，ig], As2S2high-, middle-, low-dose combined with ATO group, with consecutive treatment of 14 days. The body mass, tumor inhibition rate, index of thymus and spleen, CD4+/CD8+T in spleen were observed, and the levels of Perforin and Granzyme B mRNA in spleen were detected by RT-PCR method. Results4μM ATO significantly increased the inhibition effect of As2S2on proliferation of Lewis cell(P<0.05); the inhibition rate of As2S2middle-dose+ATO group was higher than As2S2middle-dose group(P<0.05); compared with As2S2middle-dose group, the CD8+T and CD4+/CD8+levels in spleen of As2S2middle-dose+ATO group were higher (P<0.05); the expression of GranzymeB mRNA in spleen of As2S2middle-dose+ATO group was higher than model group (P<0.05). ConclusionATO could significantly increase the proliferation inhibition of As2S2on Lewis, probably by enhancing the immune response.

As2S2; ATO; synergies; Lewis lung carcinoma; T-cells immunity

顧亞琴，女，碩士，研究方向:中藥毒理學，E-mail:guyaqin1991@126.com；張良，通信作者，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥毒理學，E-mail:zhangl_1999@163.com。

R734.2；R73-3

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.09