菟絲子提取物含藥血清對人早孕滋養層細胞增殖及凋亡的影響

劉新玉，劉昱磊，羅頌平

(1.南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院 中醫科，廣東 深圳 518038；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 婦產科，廣東 廣州 510405)

菟絲子提取物含藥血清對人早孕滋養層細胞增殖及凋亡的影響

劉新玉1Δ，劉昱磊1，羅頌平2

(1.南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院 中醫科，廣東 深圳 518038；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 婦產科，廣東 廣州 510405)

目的 探討菟絲子提取物的含藥血清對正常人早孕細胞滋養層細胞(cytotrophoblast,CTB)增殖及凋亡的調節作用。方法 雌性SD大鼠隨機分為8組，每組5只，包括空白血清對照組，減味壽胎丸組，菟絲子總提物高、低劑量組，菟絲子總黃酮高、低劑量組，菟絲子總多糖高、低劑量組，各組灌胃予對應藥物，2次/天，連續3 d后腹主動脈采血分離血清。上述空白血清或各提取物血清以不同體積(5%、10%、20%)分別培養CTB細胞，噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活力，流式細胞儀分析細胞周期。結果 MTT結果顯示，各提取物高、低濃度含藥血清培養細胞48 h后，吸光度值均一定程度增加，除5%菟絲子總提物高劑量組及5%菟絲子總多糖低劑量組外，余各組5%、10%、20%含藥血清與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。細胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴性。流式細胞儀分析結果顯示，與空白血清組比較，各組S期細胞百分比均顯著增加(P<0.05，P<0.01)；而G2/M期細胞百分比顯著減少(P<0.05，P<0.01)。干預48 h后，細胞周期分布變化趨勢與24 h一致，而且變化更明顯。結論 菟絲子各提取物高、低劑量含藥血清均可增加CTB細胞的增殖活性，降低細胞凋亡的發生。藥效最佳劑量分別為：菟絲子總提物低劑量、總黃酮高劑量及總多糖高劑量。

菟絲子；細胞滋養層細胞；總提物；總黃酮；總多糖

壽胎丸是治療先兆流產的基礎方，大量臨床及實驗研究均已證實其補腎安胎的藥效[1-2]。作為該復方的組成君藥，菟絲子具有補肝腎、益精明目、固精縮尿、止瀉安胎的功效。用于陽痿遺精，遺尿尿頻，腰膝酸軟，腎虛胎漏，胎動不安等癥。前期研究表明在降低腎虛流產模型大鼠的流產率，提高大鼠血清孕酮(P)及雌二醇(E2)水平、增加子宮蛻膜孕酮受體(PR)mRNA表達方面，壽胎丸復方中各單味藥的貢獻度依次為：菟絲子>桑寄生=續斷>阿膠[3-4]，充分體現了菟絲子在該復方中的君藥地位。前期動物實驗研究證實菟絲子總提物及其有效部位提取物菟絲子總黃酮及總多糖均可降低流產模型大鼠的流產率，具有補腎安胎的作用[5]。細胞滋養層細胞是孕早期胚胎著床及正常發育最重要的細胞之一，其增值及凋亡活性直接影響到胚胎能否正常發育或發生自然流產，因此本研究擬運用中藥血清藥理學研究方法，以人早孕細胞滋養層細胞(CTB)模型為研究載體，研究壽胎丸君藥菟絲子總提物、菟絲子總黃酮提取物及菟絲子總多糖提取物含藥血清對CTB細胞增殖、分化潛能及凋亡的影響，以期初步研究菟絲子補腎安胎的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性SD大鼠40只，7～9周齡，體質量200～250 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供(合格證號：0088328)。

1.1.2 實驗藥物：減味壽胎丸復方成分菟絲子、桑寄生及續斷三味藥材，按原方比例藥材購自廣州中醫藥學第一附屬醫院中藥房，經鑒定并按前期實驗方法[5]提取鑒定后備用。結合動物藥效實驗結果及中藥血清藥理學研究方法，確定提取物的劑量。以下藥物均以無菌0.9%NaCl溶液溶解，現用現配，用前搖勻。具體劑量及濃度見表1。

表1 菟絲子總提物及其有效部位化合物提取物不同組別劑量及濃度

1.1.3 試劑：DMEM/F12培養液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Collagenase I、雙抗(青霉素、鏈霉素)均為美國Gibico公司產品；MTT試劑盒為南京凱基生物科技發展有限公司產品；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒為碧云天公司產品。

1.1.4 儀器與設備：1X70倒置系統顯微鏡帶INFINITY全自動顯微攝像頭(OLIMPUS)；BIORAD550型酶標儀(Thermo SCIENTIFIC MULTISCAN MK3)；ALTRA EPICS型流式細胞儀(美國 BECKMAN COULTER 公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物含藥血清的制備方法及步驟：大鼠隨機分為8組，每組5只，包括：空白血清對照組(等量0.9%NaCl溶液灌胃)；減味壽胎丸組(1 g/kg劑量灌胃)；菟絲子總提物高、低劑量組(分別按臨床成人等效劑量的5倍、1倍劑量灌胃，下同)；菟絲子總黃酮高、低劑量組；菟絲子總多糖高、低劑量組。每天灌胃給藥2次，上下午各1次，連續3 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。所有大鼠于末次給藥1 h后用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血約5 mL，靜置4 h以上，1500 r/min離心10 min分離血清，56 ℃水浴鍋中水浴30 min滅活，無菌超凈臺中經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，離心管分裝并標記，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活力：將原代培養的CTB細胞以1.5×104/mL的密度接種于96孔板，100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養48 h；去除培養液，加入無血清的DMEM/F12培養液，100 μL/孔，繼續培養24 h，使細胞生長同步化。根據實驗分組方案，將細胞分成8組，每組設5個復孔。分別加入5%、10%、20%的空白對照組、減味壽胎丸組、菟絲子總提物高低劑量組、菟絲子總黃酮高低劑量組及菟絲子總多糖高低劑量組含藥血清；再于對應孔中分別加入95、90、80 μL培養液，使每孔總體積100 μL；孵育48 h；每孔加入50 μL 1×MTT，孵育4 h；吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，培養板置于平板搖床震蕩10 min使結晶物完全溶解；酶聯免疫分析儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度值(A值)。每組實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 細胞周期分析

① 細胞樣品的準備：將生長同步化的細胞加入不同組別含藥血清分別培養24、48 h；收集培養液至離心管內，0.25%胰蛋白酶消化，至細胞可被移液管吹打下來時，加入前面收集的培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞，再次收集到離心管內；1000 r/min離心5 min沉淀細胞；吸出上清，加入1 mL預冷的PBS重懸細胞，并轉移到離心管內，再次離心沉淀細胞；吸出上清，輕彈離心管底以免細胞成團。

② 細胞固定：加入1 mL預冷的70%乙醇，4 ℃過夜固定24 h； 1000 r/min離心5 min沉淀細胞；吸出上清，加入1 mL預冷的PBS重懸細胞，并轉移到離心管，再次離心沉淀細胞并小心吸出上清，避免細胞成團。

③ 染色及流式檢測和分析：每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。流式細胞儀在490 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。流式細胞儀Muhicycle分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。以DNA含量為橫坐標，受檢細胞為縱坐標作圖，用累積曲線分割法計算各期細胞所占比例。

2 結果

2.1 不同組別含藥血清對細胞增殖活性情況的影響 與空白對照組血清相比，不同組別不同濃度含藥血清培養細胞48 h后，吸光度值均有一定程度增加，與5%空白血清組比較，除菟絲子總提物高劑量組及菟絲子總多糖低劑量組差異無統計學意義外，余各組5%含藥血清均差異有統計學意義(P<0.05)；與10%空白血清組比較，各組10%含藥血清差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；與20%空白血清組比較，各組20%含藥血清差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。提示不同濃度的含藥血清均可增加細胞的增殖活性。

各組不同濃度含藥血清吸光度值比較，5%、10%、20%濃度的含藥血清分別培養細胞48 h后，吸光度值均逐漸增加，顯示細胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴性。其中空白對照組、減味壽胎丸組不同濃度間吸光度值差異無統計學意義；菟絲子總提物高、低劑量組、菟絲子總黃酮低劑量組及菟絲子總多糖高劑量組5%含藥血清與20%含藥血清吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)；菟絲子總黃酮高劑量組及菟絲子總多糖低劑量組5%含藥血清與10%含藥血清和20%含藥血清吸光度值差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；各組20%含藥血清吸光度值較10%含藥血清均有一定程度增加，但差異均無統計學意義。見表2。

菟絲子各提取物組間比較，增強細胞增殖活性效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

表2 不同組別不同濃度含藥血清干預48 h后細胞吸光度值比較Tab.2 Comparison of the absorbance value of the cells after interfered with different groups of serum extraction at different concentrations(±s，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對照組比，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，與5%含藥血清比，compared with 5%serum of extract

2.2 10%含藥血清對細胞周期影響的分析 空白對照血清培養細胞24 h后, S期細胞數量較少，而不同組別提取物10%含藥血清干預細胞24 h后，S期細胞百分比顯著增加。與空白血清組比較，各組10%含藥血清S期細胞百分比均差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；而不同組別提取物10%含藥血清干預細胞24 h后， G2/M期細胞百分比較空白對照組顯著減少(P<0.05，P<0.01)；與空白血清組比較，各組10%含藥血清G1/G0期細胞百分比則差異無統計學意義。分別用空白對照血清及10%不同組別提取物含藥血清培養細胞48 h后，細胞周期分布變化趨勢與24 h一致，而且變化更加明顯(P<0.05或<0.01)。見表3。

各組提取物含藥血清組間比較，10%不同組別提取物含藥血清培養細胞24 h及48 h后，S期細胞百分比菟絲子總多糖低劑量組與減味壽胎丸組比較差異有統計學意義(P<0.05)，余各組間比較差異無統計學意義。見表3。

菟絲子各提取物組間比較，對細胞周期分布影響效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

表3 不同組別10%含藥血清作用24 h及48 h后CTB細胞的周期分布Tab.3 Cell cycle distribution of the CTB cells after interfered with 10% serum in different groups(±s，%，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對照組比，compared with blank control group；△P<0.05，與減味壽胎丸組比，compared with Shoutaiwanjianwei group

3 討論

菟絲子是壽胎丸的君藥，其化學成分主要包括黃酮類、糖苷、氨基酸及微量元素，還有膽甾醇、蕓苔甾醇、谷甾醇、豆甾醇及三萜酸類、生物堿、香豆素、鞣酸等化學成分[6]。其中黃酮類是其主要活性成分，其次為糖類物質。同時，菟絲子黃酮能改善心血管血流動力學， 有免疫增強作用，因此它和多糖成分可能都會對菟絲子的補益活性產生影響[7]。因此本研究以菟絲子總黃酮及總多糖提取物為研究對象。

滋養層細胞對胚泡的植入及胚胎的正常發育起重要作用。滋養層細胞又分為合體滋養層細胞和細胞滋養層細胞(CTB)，前者是一個多核細胞體，位于絨毛膜表面，直接參與母體-胎兒之間物質交換，喪失了增殖能力，需要具有明顯增殖能力的CTB細胞持續增生、融合以維持其功能。細胞增殖是細胞擴增及組織和器官發育的基礎，在胚胎發育過程中起著至關重要的作用[8]。一旦此過程受到破壞或干擾，就會導致胚胎停止發育[9]。因此CTB細胞的增殖功能對妊娠維持至關重要。CTB細胞良好的增殖是胚胎正常生長的基礎，正常早孕期CTB細胞的增殖能力很強，而反復自然流產、IUGR、先兆子癇等均伴有CTB細胞的增殖能力下降[10]。

王海燕等[11]探討補腎益氣方對正常早孕期人CTB細胞增殖、侵襲、分化等生物學行為的影響，采用MTT分析了不同濃度含藥血清對CTB細胞活力的影響，發現含藥血清培養的細胞在490 nm處的光吸收值明顯高于空白對照組，且隨著給藥濃度增加，給藥時間延長，這種作用更加明顯，提示補腎中藥增強生長中的正常早孕期人CTB細胞的活力。邢長英等[12]用灌服補腎益氣方的大鼠血清處理體外培養的人CTB細胞48 h，可見人CTB細胞的增殖活力增強，且體積分數20%含藥血清的作用高于10%含藥血清(P<0.01)。提示補腎益氣方不僅促進CTB細胞增殖活力, 并且在實驗濃度范圍內, 中藥促增殖的作用隨著藥物濃度的增加而增強。馬紅霞等[13]研究菟絲子總黃酮對CTB細胞增殖能力的影響，結果提示菟絲子總黃酮呈時間和劑量依賴性增強早孕期CTB細胞活力，促進CTB細胞ERK1/2的磷酸化。推測菟絲子總黃酮可能是通過活化MAPK/ERK1/2信號通路促進CTB細胞增殖。

本研究結果亦表明菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及菟絲子總多糖高、低濃度的含藥血清均可增加細胞的增殖活性(P<0.05)。且細胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯的劑量依賴性(P<0.05)。各提取物不同劑量組對細胞增殖活性增加程度比較效果最好的分別為：菟絲子總提物低劑量組、菟絲子總黃酮高劑量組及菟絲子總多糖高劑量組。這表明作為菟絲子主要有效成分的總黃酮和總多糖物質均可增強CTB細胞的增殖活性，這可能與菟絲子作為壽胎丸復方的君藥發揮補腎安胎藥效有著密切關系。

細胞凋亡是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定的細胞主動死亡過程。早孕期CTB細胞以增殖為主，同時，正常妊娠亦存在一定程度的滋養層細胞凋亡[14]，且主要發生在合體滋養層細胞。在胚胎發育過程中，適度的細胞凋亡有利于絨毛內血管腔及分支形成。正常妊娠中滋養層細胞存在一定程度的凋亡，而流產患者的滋養細胞凋亡率則明顯增多[15]。同時滋養層細胞的凋亡具有重要的生理和病理意義，因此進行滋養層細胞凋亡的研究具有重要的理論意義和臨床價值。

王晟等[16]研究菟絲子總黃酮對無血清培養睪丸細胞所致凋亡的保護作用及其機制。采用流式細胞技術檢測睪丸細胞亞二倍體凋亡，結果顯示對照組的亞二倍體細胞含量幾乎是高劑量組的2倍。表明菟絲子總黃酮對于生精細胞具有保護凋亡作用，菟絲子總黃酮具有抗氧化、清除氧自由基、抑制睪丸細胞凋亡的作用。

本實驗研究表明各提取物10%含藥血清分別培養細胞24 h后，S期細胞百分比均較空白對照組顯著增加(P均<0.05，P<0.01)，G2/M期細胞百分比較空白對照組顯著減少(P均<0.05，P<0.01)。提示10%含藥血清培養細胞后，處于S期的細胞明顯增多，阻滯在G2-M期細胞減少，表明含藥血清可誘導細胞處于DNA合成期及有絲分裂期，促進細胞增殖，降低細胞凋亡的發生率。菟絲子各提取物組間比較，對細胞周期分布影響效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

綜上所述，本研究分別采用MTT法及流式細胞術用檢測了CTB細胞的吸光度值及細胞周期中不同時期的細胞數，分析含藥血清對細胞增殖及凋亡的影響，證實含藥血清能促進細胞增殖，同時抑制細胞凋亡。結果提示：菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及總多糖提取物高、低濃度的含藥血清均可增加細胞的增殖活性。且細胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴性。10%含藥血清培養細胞24、48 h后，處于S期的細胞明顯增多，阻滯在G2-M期細胞減少，表明含藥血清可誘導細胞處于DNA合成期及有絲分裂期，促進細胞增殖，降低細胞凋亡的發生率。菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及總多糖提取物高低劑量組與減味壽胎丸組均能促進細胞增殖，降低細胞凋亡的發生率，這為菟絲子作為該復方的主要成分發揮治療作用提供了參考依據，也為后續進一步研究菟絲子主要有效部位提取物的藥效作用奠定了基礎，但因為時間所限，本研究僅觀察了菟絲子提取物對CTB細胞增殖及凋亡的影響，并未設置對照細胞作為參考，課題組成員后續進一步研究了減味壽胎丸及其有效成含藥血清對人早孕蛻膜細胞凋亡的影響。結果顯示減味壽胎丸及有效成分可不同程度抑制人早孕蛻膜凋亡[17]。提示該復方及其有效成分可能通過對CTB細胞及蛻膜細胞增殖凋亡同時產生影響而發揮補腎安胎藥效，在此基礎上目前本課題組在進一步深入研究減味壽胎丸含藥血清對CTB細胞凋亡相關蛋白因子表達的影響，相關研究結果待進一步分析總結后發表。

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(編校：王儼儼)

Effects of different extraction serum of semen cuscutae on cell proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells

LIU Xin-yu1Δ, LIU Yu-lei1, LUO Song-ping2

(1. Department of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518038, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)

ObjectiveTo observe the effects of serum of the different semen cuscuta extraction on proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells.MethodsThe female SD rats were randomly divided into 8 groups, 5 rats in each group, including blank control group, Shoutaiwanjianwei group, high and low dose of semen cuscuta total extract, high and low dose of semen cuscuta general flavones, high and low dose of semen cuscuta total polysaccharides, the rats in each group were administrated with corresponding drugs by gavage, twice daily, after consecutive treatment of 3 days, the blood samples were collected from abdominal aorta, then serum was separated.CTB cells were cultivated with serum of above blank control and different extracts at different volume(5%, 10%and 20%), the cell proliferation was detected by MTT and cell cycle was analysed by flow cytometry.ResultsMTT results showed,after treated with the high and low dose of drug containing serum for 48 hours, the optical density accelerated in a certain degree, the 5%, 10%and 20%of each group were significantly different from that of blank control group(P<0.05 orP<0.01)except for 5%high dose of semen cuscuta total extract and 5%low dose of semen cuscuta total polysaccharides.The proliferation increased with the concentration of serum dosage in an obvious dosage dependent tendency.The flow cytometry results showed, the percentage of S-phase were obviously accelerated than the blank group(P<0.05 or <0.01), while the percentage of G2/M phase were obviously reduced compared with blank group(P<0.05 or <0.01).Changes of 48h’s treatment were accordance with the 24 h’s with the more significant change.ConclusionHigh and low dose of serum semen cuscuta extracts could increase the proliferative activity of the CTB cells and reduce the apoptosis of the cells, the best ones are the low dose of semen cuscuta total extract, high dose of general flavones, high dose of total polysaccharides respectively.

semen cuscutae; cytotrophoblast; total extract; total flavonoids; total polysaccharides

國家自然科學基金面上項目(81273795)；廣東省中醫藥局“建設中醫藥強省”科研項目(20152058)；廣東省建設中醫藥強省專項資金項目([2015]102號)

劉新玉，通信作者，女，博士，主治醫師，研究方向：自然流產的中醫藥防治，E-mail：liuxinyu0611@163.com。

R285

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.12